抗辐灵活性成分对Nrf2-Keapl信号通路激活在微波辐射后神经细胞损伤的保护作用研究

摘要

随着微波技术在工业、医疗、通讯、军事及生活等各个领域的广泛应用，人类越来越多地暴露于微波辐射之中。微波辐射生物学效应及机制日渐成为研究热点，其对神经、心血管、免疫及生殖等多个系统的影响也越来越受到重视。研究表明，微波辐射可引起多种生物学效应，并对人类健康产生影响。中枢神经系统是微波辐射最为敏感的靶部位，微波辐射对其最显著的影响是对学习和记忆功能的损害，但相关的损伤机制尚未阐明，且存有不少争议，尤其是微波辐射对神经细胞的实时效应以及神经细胞突起影响鲜有研究。抗辐灵（Kang-fu-ling，KFL）是本课题组针对微波辐射的生物损伤特点，研发的抗微波辐射损伤的中药复方，其对微波辐射致脑损伤是否有保护作用及其机制，尤其是基于其对核因子E2相关因子2(nuclear factor-E2-related factor2，Nrf2)-Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1(Kelch-like epichlorohydrin-associated protein1，Keap1)信号通路激活调控在微波辐射后神经细胞损伤的保护作用研究尚述空白。
　　本研究首先以大鼠原代海马神经元及类神经元大鼠嗜铬细胞瘤细胞系(ratpheochromocytoma cell line，PC12)细胞作为研究对象，利用适用于激光共聚焦实时观察的脉冲微波辐射装置，并结合微速摄影(time-lapse)技术，采用Fluo4和重组钙指示剂质粒RP研究了电磁辐射与神经细胞的早期相互作用，即各亚细胞结构（胞浆、线粒体及胞核）[Ca2+]，以期探寻微波辐射致神经细胞损伤的机制。采用比吸收率(special absorption rate，SAR)为4 W/kg的微波辐射神经元及PC12细胞，结果显示海马神经元及类神经元PC12细胞的[Ca2+]均未见明显变化;采用平均功率密度为30mW/cm2高功率微波(high power microwave，HPM)辐射后即刻，大鼠原代海马神经元和PC12细胞的活性氧(reactive oxygen species，ROS)水平均显著上升，此外30mW/cm2 HPM辐射原代海马神经元会导致其突起减少变短，表明该条件微波辐射可引起神经细胞氧化应激性损伤，并且能够抑制原代海马神经元突起生长。
　　本研究在复制微波辐射致脑损伤模型的基础上，通过Morris水迷宫检测大鼠学习和记忆能力、HE检测海马组织学以及电镜观察超微结构明确了KFL对抗微波辐射致脑损伤的保护作用。并从抗氧化方面分析KFL抗微波辐射损伤机制。结果发现，KFL及其活性成分抗辐灵甲醇提取物(methanol fraction of Kang-fu-ling，KFL-M)均具有较高的体外清除自由基活性，并且其能够很好的抑制微波辐射造成的神经细胞氧化应激性损伤。
　　Nrf2-Keap1信号通路是细胞对抗氧化应激最重要的细胞防御机制，Nrf2通过与胞浆蛋白Keap1以及抗氧化元件(antioxidant response element，ARE)相互作用，能够启动下游编码抗氧化蛋白和Ⅱ相解毒酶的基因表达，发挥细胞保护作用。谷氨酰半胱氨酸连接酶(glutamate cysteine ligase，GCL)、1型血红素氧化酶(hemeoxygenase-1，HO-1)、还原型辅酶Ⅰ醌类氧化还原酶(NADPH quinoneoxidoreductase，NQO1)、硫氧还蛋白还原酶1(thioredoxin Reductase1，Txnrd1)、过氧化物酶基因1(peroxiredoxin1，Prdx1)等都是该通路的下游产物。本研究通过Western Blot检测该通路关键蛋白Nrf2的核、浆蛋白分布及qPCR检测通路下游产物mRNA表达水平发现，KFL及KFL-M能够激活Nrf2-Keap1信号通路，并且促进其下游编码抗氧化蛋白和Ⅱ相解毒酶的基因表达(HO-1，NQO1，GSTmu3)。激活Nrf2-Keap1信号通路增强抗氧化能力应该是KFL发挥抗微波辐射致神经损伤的主要机制之一。
　　为了进一步揭示Nrf2-Keap1信号通路对微波辐射致神经细胞损伤的保护作用，本研究采用过表达Nrf2蛋白及Keap1蛋白的方法，从而激活和抑制Nrf2-Keap1信号通路，发现激活Nrf2-Keap1信号通路可以抑制微波辐射导致的PC12细胞氧化应激，而抑制Nrf2-Keap1信号通路则会加重微波辐射导致的PC12细胞氧化应激，使PC12细胞对微波辐射更为敏感。利用该信号通路激动剂t-BHQ激活PC12细胞和大鼠原代海马神经元Nrf2-Keap1信号通路也同样能抑制微波辐射导致的氧化应激，并且能够逆转微波辐射导致的神经元突起生长障碍。
　　本论文研究了微波辐射对神经细胞影响的实时生物效应，进行了KFL对微波辐射致脑损伤的保护作用，并对其机制进行了探讨。在此基础上，深入研究了Nrf2-Keap1信号通路对微波辐射造成的神经细胞氧化应激损伤的调控机制。该研究为利用该通路作为防治微波辐射造成神经损伤的靶点、为抗微波辐射损伤药物的寻找提供了新的思路和方向。

目录

声明

缩略词表

摘要

前言

参考文献

第一部分 微波辐射对原代海马神经元及PC12细胞实时[Ca2+]、ROS及突起生长的影响

研究背景

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

第二部分 抗辐灵对微波辐射致大鼠脑损伤保护作用的探索研究

研究背景

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

第三部分 抗辐灵通过抗氧化作用对微波辐射致大鼠脑损伤保护作用研究

研究背景

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

第四部分 抗辐灵甲醇提取物对微波辐射致PC12细胞氧化应激保护作用研究

研究背景

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

第五部分 Nrf2-Keap1信号通路激活对微波辐射致神经细胞氧化应激保护作用研究

研究背景

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

全文结论

文献综述

代表性论著

附录

个人简历

攻读博士学位期间发表论文及获批专利等一览表

致谢