HIV-1特定基因突变的耐药性鉴定及其对病毒复制的影响

摘要

我国艾滋病免费抗病毒治疗开始于2003年，其覆盖率到2011年9月底达到73.5％。随着抗病毒治疗时间的延长，HIV-1感染者中抗病毒治疗失败的情况不断出现，耐药性毒株成为治疗失败的主要原因。我国艾滋病的抗病毒治疗具有鲜明的特点，一是我国流行的HIV-1毒株以CRF01_AE、CRF07_BC、CRF08_BC及B亚型为主，与欧美等国以B亚型为主的情况显著不同;二是使用的抗病毒药物为国产仿制药;三是采取乡镇医疗和疾控机构统一发药及管理病人的治疗模式。这些特点使得我国HIV-1毒株的耐药性具有自己的特点和规律。我国已经开展了HIV-1耐药毒株的流行病学监测，获得了耐药毒株的流行率、影响因素、对抗病毒治疗的影响等一系列重要的数据。在抗病毒治疗发展的过程中，不断有突变被新鉴定为耐药突变，新突变对HIV-1耐药的影响、突变模式、突变之间的相互作用以及新突变对HIV-1毒株的复制能力的影响还没有深入的研究。本课题首先对部分地区HIV-1感染者的基线耐药和HIV-1抗病毒治疗失败后的耐药情况进行了分子流行病学研究。随后对与抗病毒治疗相关的突变及突变组合构建了质粒，转染后利用重组病毒对我国常用抗病毒治疗药物进行了耐药表型检测，并使用合适的方法分析了单一位点的作用和不同位点之间可能存在的相互作用。最后对携带相关突变组合的病毒株的复制能力进行了研究。
　　综合全部研究结果，旨在掌握我国HIV-1耐药毒株流行情况、阐明突变之间的相互作用及携带耐药突变病毒的生物学特征，为临床深入认识HIV-1耐药机理及耐药病人的科学管理提供理论依据、为确保我国抗病毒治疗效果提供实际指导。
　　第一部分我国部分地区HIV-1基因型耐药的横断面研究
　　目前，耐药HIV-1毒株在我国各地广泛出现和流行，掌握耐药毒株流行状况是临床有效治疗病人的基础。本部分研究旨在了解我国HIV-1耐药毒株的分子流行病学特征，为进一步研究和临床抗病毒治疗提供指导。我们收集2009年全国范围内8个省市的304例从未接受抗病毒治疗的艾滋病患者的血浆标本和2010年河南和河北两省476例一线抗病毒治疗失败的艾滋病患者的血浆标本，采用HIV-1基因型耐药检测方法进行了基因型耐药检测，扩增目的基因片段长2.0 kb，包含HIV-1蛋白酶的99个氨基酸和逆转录酶的560个氨基酸，计算耐药毒株流行率并分析耐药相关的因素。
　　结果:(1)2010年河南省和河北省抗病毒治疗失败标本扩增检测成功321份，耐药率高达67.6％，NRTIs和NNRTIs耐药分别达到了54.21％(174/321)和65.42％(210/321)。NRTIs耐药突变主要是TMAs突变和M184V; NNRTIs耐药突变中以K103N和Y181C最为常见，其次是G190A/S和H221Y。Y181C和H221Y联合突变在河北省和河南省的耐药标本中分别占到23.33％(7/30)和16.58％(31/187)，K103N/Y181C/H221Y在河北省和河南省耐药标本中分别占6.67％(2/30)和11.76％(22/187)。(2)未接受抗病毒治疗的标本扩增检测成功269份，基线耐药率为7.43％;深圳的基线耐药为17.86％，显著高于其他地区(x=4.9327，P=0.0264);B亚型的基线耐药显著高于非B亚型(P=0.0177);NNRTIs耐药突变包括K103N、Y181C、V179D/E、G190E和K238N; PIs耐药突变中包括能够引起NFV高度耐药的N88S、D30N和L90M。在这些标本中，新报道的HIV-1流行重组毒株CRF5501B在2009年广州和深圳的男男性行为人群中的流行率为9.84％。
　　结论:受到样本量和标本保存的影响，部分地区的扩增成功率较低，可能对结果有影响。本研究提供了部分地区抗病毒治疗失败耐药和基线耐药的概貌。河南和河北抗病毒治疗失败标本中耐药毒株的流行率非常高，严重地影响后续抗病毒治疗效果。HIV-1基线耐药的流行受到地区和病毒亚型的影响。近年来增长的男男性行为人群中HIV-1的亚型更为复杂。跟踪基线耐药病人的抗病毒治疗效果有助于阐明基线耐药对抗病毒治疗的影响。
　　第二部分HIV-1特定基因突变的耐药性鉴定
　　HIV-1的耐药突变十分复杂，截止到2008报道的突变已经达到200多个，且不断有新的耐药相关突变位点被发现和鉴定。在药物选择压力下，一些病毒基因的天然多态性位点很容易转变为耐药相关突变位点。目前，主要耐药突变位点的作用已经清楚，但对很多新出现的和由多态性位点转变为而来的突变的耐药作用及其与主要突变之间的相互作用尚不明确。我国流行的HIV-1毒株亚型、我国独特的群体性治疗模式使得耐药突变的发生和流行具有鲜明的特点。本研究的目的是阐明在我国接受抗病毒治疗的艾滋病患者中广泛流行的H221Y对耐药的作用及其与其他突变的相互作用。我们从3名临床耐药的艾滋病患者血浆标本中扩增获得含有不同耐药突变组合(K103N/Y181 C/H221 Y/T215Y、V179E/Y181 C/H221 Y/T215Y、K101Q/Y181C/H221Y)的3段HIV-1 pol区基因，以HIV-1 pNL4-3为骨架构建重组病毒。以此为基础，对特定位点进行定点突变或回复突变、转染人胚肾细胞（Human embryonic kidney，HEK293T），收获病毒，构建含有不同突变组合的21株病毒，在MT2细胞上对病毒进行培养扩增，测定感染性滴度(50％ tissue culture infectious dose，TCID50)，在TZM-bl细胞上测定这些病毒对4种抗HIV药物的敏感性，以pNL4-3病毒上定点突变的3株病毒作为参比。每种药物设11个浓度梯度、2复孔、重复3次，计算50％抑制浓度（50％ inhibition concentration，IC50），采用析因设计的分析方法计算各个突变对耐药的贡献及突变之间的相互作用。
　　结果:(1) K103N/T215Y显著提高EFV对病毒的IC50(88.98-fold)，V179E/T215Y、Y181C和K101Q分别使EFV对病毒的IC50提高18.46-fold、6.12-fold和6.76-fold，H221Y单一突变几乎不影响EFV的IC50值(1.41-fold)。分别使EFV的IC50提高88.98-fold和18.46-fold的K103N/T215Y和V179E/T215Y联合突变均与H221Y无交互作用，而分别使EFV的IC50提高6.12-fold和6.76-fold的Y181C和K101Q均与H221Y有显著交互作用(F=12.49，P=0.0028;F=28.10，P＜0.0001)。H221Y可拮抗K101Q对EFV的耐药作用，使其相对于野生型的IC50由提高6.76-fold降低到二者相当。(2) K103N/T215Y和V179E/T215Y均显著提高AZT对病毒的IC50（30.66-fold，13.72-fold）。Y181C显著的降低了AZT对病毒的IC50(0.335-fold)。H221Y对IC50的影响随着基础突变变化较大。分别使AZT的IC50提高30.66-fold和13.72-fold的K103N/T215Y和V179E/T215Y联合突变均与H221Y无交互作用，而分别使AZT的IC50改变0.335-fold和1.50-fold的Y181C和K101Q均与H221Y有显著交互作用(F=18.71，P=0.0051; F=10.53，P=0.0011)。H221Y可拮抗Y181C对AZT的耐药作用，使其相对于野生型的IC50由降低0.335-fold提高到二者相当。(3) K101Q单一位点使3TC对病毒的IC50降低0.48-fold，K103N/T215Y、V179E/T215Y和Y181C对3TC的IC50几乎没有影响（1.35-fold、0.80-fold、1.29-fold）。H221Y对IC50的影响随着基础突变变化较大。H221Y可拮抗K101Q对3TC的耐药作用，H221Y与V179E/T215Y有显著的拮抗作用。K101Q、K103N/T215Y、V179E/T215Y和Y181C均不会使d4T的IC50显著改变，H221Y单一位点显著提高d4T对病毒的IC50(4.71-fold)。181和221之间不存在交互作用(P=0.9708)。
　　结论:(1)我们首次采用析因分析设计实验方法及分析检验方法发现了221单一位点突变对耐药的贡献及与其他位点的交互作用。(2) H221Y单一位点对d4T的耐药显著提高，对EFV的耐药提高较小，对AZT和3TC的作用随着一起出现的突变位点而不同。(3) Y181C单一位点显著提高AZT的敏感性。(4)基础突变分别对EFV和AZT耐药的影响显著时，H221Y单一位点对耐药的作用及与基础位点之间的交互作用不显著。
　　第三部分携带耐药相关突变的HIV-1毒株的复制能力的研究
　　HIV-1耐药突变可能使病毒的酶活性受损，导致复制能力下降，但病毒也可能发生补偿突变，弥补复制能力的损失。本研究的目的是阐明携带常见耐药突变的HIV-1毒株的复制能力。我们采用平行培养的方法，将第二部分研究中构建的病毒等量接种MT2细胞，在没有药物压力的条件下培养10天，定期取培养上清接种TZM-bl细胞，48小时(hour, h)后测定荧光值，以野生型pNI4-3为参比，绘制病毒的复制动力学曲线，用具有一个重复测量的两因素定量资料的假设检验方法对结果进行分析。
　　结果:(1) pNL4-3179/181/215复制能力在MT2细胞上最强，第三和四天分别提高71.69倍和132.94倍。(2)培养第五天后几乎所有耐药毒株的复制能力都高于野生毒株（2.21倍数-145.69倍）。(3)Y181C和H221Y突变均使pNL4-3179/215的复制能力在第6天和第7天显著的提高(P=0.0066，P＜0.0001，P=0.0363，P＜0.0001)，在pNL4-3103/215病毒携带的突变基础上表现出相反的结果(P＜0.0001)。
　　结论:(1)首次发现携带突变V179E/Y181 C/T215Y、V179E/H221 Y/T215Y、V179E/T215Y、K103N/T215Y、K103N/Y181 C/T215Y的复制能力强于野生毒株。(2)复制能力的提高也可能是这些毒株耐药的一个因素。(3)应高度警惕高耐药高复制的HIV-1毒株的流行，进行密切监测。

目录

声明

缩略词表

摘要

前言

1．HIV-1的流行现状

2．HIV-1抗病毒治疗研究现状

3．HIV-1的耐药性研究现状

4．HIV-1耐药的分类及耐药检测方法

5．HIV-1复制能力的研究现状

第一部分 我国部分地区HIV-1基因型耐药的横断面研究

1．研究对象

2．实验流程

3．实验方法

4．实验结果

5．讨论

6．结论

第二部分 HIV-1特定基因突变的耐药性鉴定

1．实验原理及技术流程

2．实验材料

3．实验方法

4．实验结果

5．讨论

6．结论

第三部分 HIV-1特定基因突变对病毒复制能力的影响

1．原理与流程

2．实验材料

3．实验方法

4．实验结果

5．讨论

6．结论

参考文献

附表

综述 HIV-1的耐药流行和复制能力的改变

代表性论著

个人简历

致谢