FGF2在甲型H1N1流感病毒感染肺损伤中的作用机制研究

摘要

甲型H1N1流感病毒感染人体能够造成严重的急性肺损伤，具有较高的发病率和致死率。甲流感染伴有多种细胞因子水平升高，这些因子在肺损伤中的作用机制也陆续被揭示。有研究发现，在多个组织损伤和炎症模型中均检测到有FGF2细胞因子水平升高，然而目前关于FGF2在流感诱导的急性肺损伤中的作用机制还未曾有报道。FGF2是一个多效性的细胞因子，不仅能够促进细胞增殖、血管生成，而且参与组织损伤修复，诱导胚胎发育等多种生物学过程。本研究试图探究FGF2在甲型H1N1流感病毒感染引起的急性肺损伤中的作用机制。
　　首先分析了甲型H1N1流感患者体内以及甲型H1N1流感病毒(A/Beijing/501/2009)感染致小鼠肺损伤模型中FGF2分子的表达水平，结果表明甲流患者血清中FGF2水平显著高于正常人群，在小鼠肺泡灌洗液中FGF2的水平呈显著上升趋势。A/Beijing/501/2009感染致小鼠肺损伤模型中，用FGF2中和抗体干预后，发现小鼠肺损伤更为严重，体重和存活率下降，其中早期抗体干预比晚期干预小鼠发病更为严重。同样的，FGF2缺陷小鼠表现出对A/Beijing/501/2009以及A/Puerto Rico/8/1934流感病毒更为易感，小鼠肺损伤更重、死亡率更高。相反，用FGF2重组蛋白给药后，小鼠病情减轻，存活率明显上升。以上这些结果表明，FGF2在甲型H1N1流感病毒诱导的急性肺损伤中起保护作用。进一步研究发现，FGF2缺陷小鼠感染甲型H1N1流感病毒后，早期肺泡灌洗液中炎性细胞的募集量明显少于野生型小鼠，其中主要以中性粒细胞和巨噬细胞为主。同时还发现，在FGF2缺陷小鼠肺泡灌洗液中，多种细胞因子水平显著低于野生型小鼠，综合表现出FGF2敲除后不能激发有效的保护性炎症应答。以上结果预示着FGF2敲除后这些有差异的炎性细胞和细胞因子可能在流感感染致小鼠死亡的早期发挥着重要的保护功能。此外，在FGF2缺陷小鼠肺组织中检测到较高的病毒载量，而FGF2给药治疗能够降低小鼠肺部病毒载量。最后，我们还发现FGF2主要分泌细胞来源是肺上皮细胞，而非中性粒细胞或者巨噬细胞。进一步研究FGF2介导的肺损伤中下游信号通路发现，FGF2极有可能参与了P38介导的MAPK信号通路，预示着该信号通路的激活很可能在保护小鼠感染缓解肺损伤中发挥重要作用。
　　近年来，关于miRNA和炎症应答关系的研究已经成为感染免疫中研究的热点，但目前对于miRNA在甲型H1N1流感病毒感染中的作用机制仍然知之甚少。是否存在关键的miRNA在甲型H1N1流感病毒感染中发挥重要功能还不得而知。通过检测甲型H1N1流感病毒感染诱导miRNA的表达水平，我们发现甲型H1N1流感病毒感染能够造成miRNAs表达紊乱。将表达显著下调的miRNA对FGF2靶基因进行预测，筛选并验证了能够显著抑制FGF2基因表达的miRNA，包括miR-194-5p、miR-25-3p、miR-92b-3p、miR-361-5p、miR-15b-5p、miR-22-3p、miR-17-5p、miR-503-5p和miR-16-5p。进一步验证抑制倍数在2倍以上的miRNA对FGF23'UTR的作用，我们构建了6个FGF23'UTR短片段，分别检测了对应miRNA的作用，同时我们也构建了每个miRNA在3'UTR上对应的突变质粒，找到了miRNA与FGF23'UTR的具体结合位点。研究发现miR-194-5p、miR-361-5p、miR-92b-3p、miR-25a-3p、miR-16-5p、miR-15a-5p、miR-15b-5p和miR-503-5p这8个miRNA与FGF23'UTR有直接的作用，而作用位点即每个miRNA对应的3'UTR上突变的位点。此外，在细胞和小鼠模型中验证了这些miRNA的表达水平，并且验证了这些miRNA的功能，找到了关键的miRNA调节FGF2介导的肺损伤保护过程，而miRNA的拮抗剂又能够治疗流感感染引起的小鼠肺损伤，因此，研究miRNA也为甲型H1N1流感病毒感染造成急性肺损伤的治疗提供了新的研究方向。
　　分泌型FGF2与细胞表面高亲和力受体(FGFR)结合后，能够促进受体二聚化，激活胞内酪氨酸激酶活性，导致下游多条信号通路的活化。FGFR包括FGFR1-4四个成员，属于酪氨酸激酶受体亚家族。有研究发现用广谱酪氨酸激酶抑制剂能够促进流感病毒的复制，然而FGFR家族各成员是否也参与了流感病毒的复制还不是很清楚，它们是否参与了FGF2介导的肺损伤保护机制也有待研究。我们用甲型H1N1流感病毒（PR8和H5N1）感染人肺上皮细胞A549，检测了四种受体成员的表达水平，发现FGFR1和FGFR4表达丰度较高，而FGFR2和FGFR3表达相对较少，病毒感染后造成FGFR1和FGFR4表达显著下调。进一步用siRNA介导的基因表达沉默，确定了FGFR1敲除能够显著促进甲型流感病毒的复制，而FGFR4却没有该效应。相反，由慢病毒介导的FGFR1过表达能够抑制流感病毒复制，而FGFR4不具有该效应。另外，PR8感染不仅能够下调FGFR1蛋白水平，而且能够下调其磷酸化水平。用FGFR1选择性抑制剂PD173074能够明显促进流感病毒的复制，说明FGFR1激酶活性对流感病毒复制有很重要的影响。进一步，我们还发现FGFR1敲除能够明显促进流感病毒早期侵入，通过研究FGFR1对病毒结合和进入细胞过程的影响，我们发现FGFR1对病毒结合细胞表面没有影响，而是对病毒内吞过程有抑制作用，这种效应在PR8和H5N1上都得到了验证。我们的研究结果证明了FGFR1在流感感染过程中的重要作用，提示着该受体很可能参与了FGF2介导的肺损伤保护机制。

目录

声明

缩略词表

摘要

第一部分 FGF2在甲型H1N1流感病毒感染小鼠肺损伤中的作用机制研究

前言

1．实验材料

1．1 实验动物

1．2 毒株和细胞系

1．3 病人样本

1．4 主要生化试剂和抗体

1．5 试剂盒

1．6 主要仪器及设备

2．实验方法

2．1 酶联免疫法测定细胞因子浓度

2．2 实时定量检测基因表达

2．3 流感病毒感染小鼠实验

2．4 小鼠给药实验

2．5 小鼠肺病理检测

2．6 肺支气管肺泡灌洗液中自细胞亚群流式分析

2．7 分离小鼠中性粒细胞

2．8 分离小鼠腹腔巨噬细胞

2．9 分离小鼠肺上皮细胞

2．10 Western blot法检测蛋白磷酸化水平

2．11 统计学分析

3．实验结果

3．1 甲型H1N1流感患者血清样本中FGF2升高

3．2 BJ501毒株感染小鼠肺泡灌洗液中FGF2升高

3．3 FGF2中和抗体早期干预加重小鼠肺损伤

3．4 PR8毒株感染FGF2缺陷小鼠后发病较野生型小鼠感染更重

3．5 BJ501毒株感染FGF2缺陷小鼠后发病较野生型小鼠感染更重

3．6 FGF2重组蛋白药物保护小鼠感染PR8毒株并缓解肺损伤

3．7 FGF2重组蛋白药物保护小鼠感染BJ501毒株并缓解肺损伤

3．8 FGF2缺陷小鼠感染流感病毒后肺组织中性粒细胞明显低于野生型

3．9 FGF2缺陷小鼠感染流感病毒后肺灌洗液细胞因子水平低于野生型

3．10 FGF2缺陷小鼠肺组织中病毒载量高于野生型

3．11 FGF2主要分泌细胞来源的确定

3．12 FGF2参与BJS01感染引起小鼠急性肺损伤中信号通路的鉴定

讨论

结论

参考文献

第二部分 靶向FGF2基因的miRNA筛选及其在小鼠肺损伤中的作用机制研究

前言

1．实验材料

1．1 毒株

1．2 细胞系

1．3 细胞培养试剂

1．4 其它试剂

1．5 实时定量引物

1．6 主要仪器设备

2．实验方法

2．1 细胞感染病毒实验

2．2 实时定量检测FGF2基因的表达

2．3 实时定量检测miRNA的表达

2．4 miRNA mimic转染A549细胞

2．5 双荧光素酶报告质粒的构建

2．6 双荧光素酶报告系统检测

3．实验结果

3．1 A549细胞感染BJS01最佳感染剂量和感染时间的确定

3．2 芯片检测差异性表达miRNA

3．3 预测和筛选靶向FGF2基因的miRNA

3．4 miRNA差异表达分析

3．5 筛选与FGF2 3’UTR作用的miRNA

3．6 miRNA与FGF2 3’UTR作用位点的确定

讨论

结论

参考文献

第三部分 FGFR1在甲型流感病毒复制中的作用机制研究

前言

1．实验材料

1．1 毒株

1．2 细胞系

1．3 细胞培养试剂

1．4 其它试剂

1．5 实时定量引物

1．6 扩增目的片段引物

1．7 主要仪器设备

2．实验方法

2．1 细胞感染病毒实验

2．2 Western Blot分析FGFR家族成员蛋白表达量

2．3 实时定量检测基因表达

2．4 siRNA介导的FGFR沉默实验

2．5 免疫荧光法检测病毒感染效率

2．6 FGFR在A549细胞中过表达

2．7 病毒结合和进入实验

3．实验结果

3．1 PR8流感病毒感染A549细胞后检测FGFR家族成员表达水平

3．2 siRNA介导的FGFR1敲除能够上调PR8和H5N1流感病毒的复制

3．3 FGFR1敲除增强流感病毒感染早期的侵入效率

3．4 FGFR1过表达下调流感病毒的复制

3．5 FGFR抑制剂能够增加流感病毒的复制

3．6 FGFR1抑制流感病毒感染早期的内吞过程

讨论

结论

参考文献

综述 碱性成纤维细胞生长因子的研究进展

代表性论著

个人简历

致谢