大肠杆菌黏附素EtpA酵母工程菌对肠道菌群和黏膜免疫的影响

摘要

产肠毒素性大肠杆菌（Enterotoxigenic Escherichia coli，ETEC）属于致病性大肠杆菌的一种，常因食物及水源的污染而引发人和动物的感染，特别是在初生动物中有很高的发病率、死亡率，制约了养殖行业的发展，同时威胁了人类的健康。研究发现，其主要致病因子是肠毒素和黏附素。Etp A属于黏附素中的一种，分子量较大，能与肠上皮细胞上的特异性受体结合，在细菌和肠壁之间形成分子桥，介导ET EC的黏附。E tpA在不同血清型的E TEC中表达高度保守，同源性很高。另有实验证实，Etp A具有良好的免疫原性，能够有效阻止ETEC对肠道上皮细胞的黏附。这一发现为预防ETEC引起的动物腹泻，开拓了新的思路。
　　为了降低由ETEC造成的经济损失，减弱ETEC对动物健康的损害，在寻找有效的预防办法的同时，提高动物的免疫功能也至关重要。动物肠道面积巨大，其中聚居着数量庞大的微生物菌群称为肠道菌群；肠道黏膜还拥有丰富的免疫细胞及免疫分子，参与构成机体抵御病原微生物侵入的肠道黏膜免疫系统。其中有益菌群的增加能调节肠道菌群结构的稳定性，丰富菌群多态性，促进肠道黏膜生长，刺激肠黏膜分泌免疫分子，提高肠道黏膜免疫功能，帮助机体抵御病原微生物的侵袭。
　　酿酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）是酵母菌科（Saccharomycetaceae），酵母菌属（Saccharomycodes）的成员，属于益生菌的一种。在研究其益生作用时发现，它含有丰富的营养物质和未知生长因子，能提高动物的生产性能，促进肠道黏膜发育，增加有益菌群的数量，增强肠道黏膜免疫功能。本课题组通过基因克隆、同源重组等技术，使大肠杆菌黏附素 Etp A在酿酒酵母菌中高效表达，成功构建出Etp A酵母工程菌。并在细胞实验中发现，Etp A酵母工程菌能有效阻止ETEC对肠上皮细胞的黏附，具有保护上皮细胞的作用。
　　本研究在此基础上进行了以下实验：
　　1.本研究选取断奶日龄21d的SPF级健康SD大鼠120只，雌雄各半。随机分为3组：空白对照组、酿酒酵母菌组（以下简称为酿酒酵母组）、Etp A酵母工程菌组（以下简称为Etp A组），每组40只，雌雄各半。实验期间分别给3组大鼠灌服生理盐水、107CFU/mL酿酒酵母菌菌液、107 CFU/mL EtpA酵母工程菌菌液，每天1次，每次2mL/只，共持续28d；然后连续3d灌服108 CFU/mL大肠杆菌（H10407）菌液，每天1次，每次5 mL/只。分别于实验第7、14、21、28d和结束灌服大肠杆菌菌液3d后，取各组大鼠粪便。通过末端限制性片段长度多态性（T-RFLP）、实时荧光定量PCR、pH值检测技术，研究了Etp A酵母工程菌对肠道菌群OTU（微生物可操作单元）和pH值的影响，以及对肠道重要菌群：类杆菌（Bacteriodes）、梭菌（Clostridium）、肠球菌（Enterococcus）、双歧杆菌（Bifidobacterium）、乳杆菌（Lactobacillaceae）数量的影响。
　　2.本研究分别于实验第7、14、21、28d和结束灌服大肠杆菌菌液3d后，采集大鼠十二指肠、空肠、回肠组织。通过组织切片观察、酶联免疫吸附实验（ELISA）、实时荧光定量PCR技术研究了Etp A酵母工程菌对十二指肠、空肠、回肠绒毛长度、宽度、肠隐窝深度、绒毛长度/隐窝深度（ V/C）的影响；对肠道黏膜中重要免疫分子：分泌型免疫球蛋白A（SIgA）、白介素-2（IL-2）、白介素-4（IL-4）及干扰素-γ（IFN-γ）分泌量的影响。
　　实验结果如下：
　　1. EtpA酵母工程菌对肠道菌群的影响：
　　（1）Etp A酵母工程菌对肠道菌群多态性的影响：酿酒酵母组和Etp A组的OTU值在7、14、21、28d均高于空白对照组，并在第14d达到最大值，均与空白对照组差异极显著（P＜0.01），但酿酒酵母组和Etp A组间无显著差异（P＞0.05）。灌服ETEC后，EtpA组与灌服前无明显差异（P＞0.05），且显著高于酿酒酵母组（P＜0.05），极显著高于空白对照组（P＜0.01）。
　　（2）Etp A酵母工程菌对肠道重要菌群的影响：酿酒酵母组和Etp A组的重要菌群数量在7~28d均高于空白对照组。①酿酒酵母组和 EtpA组的类杆菌数量在第21d、28d显著高于空白对照组（P＜0.05），酿酒酵母组和EtpA组间无显著差异（P＞0.05）。灌服ETEC后，EtpA组与灌服前无明显差异（P＞0.05），且极显著高于酿酒酵母组和空白对照组（P＜0.01）。②酿酒酵母组和Etp A组的梭菌数量在第14d增长量最大，且14d、28d时，均极显著高于空白对照组（P＜0.01），酿酒酵母组和Etp A组间无显著差异（P＞0.05）。灌服ETEC后，仅有空白对照组显著高于灌服前（P＜0.05），与酿酒酵母组、EtpA组均无显著差异（P＞0.05）。③酿酒酵母组和EtpA组的肠球菌数量在第14d出现显著增长，于第21d，极显著高于空白对照组（P＜0.01），酿酒酵母组和 Etp A组间无显著差异（P＞0.05）。灌服ETEC后，EtpA组与灌服前无明显差异（P＞0.05），空白对照组、酿酒酵母组均显著高于灌服前（P＜0.05），各组之间无显著差异（P＞0.05）。④酿酒酵母组和Etp A组的双歧杆菌数量从第7d起明显增高，于第14d，极显著高于空白对照组（P＜0.01），酿酒酵母组和Etp A组间无显著差异（P＞0.05）。灌服 ETEC后， Etp A组与灌服前无明显差异（P＞0.05），显著高于酿酒酵母组（P＜0.05），极显著高于空白对照组（P＜0.01）。⑤酿酒酵母组和 Etp A组的乳杆菌数量在第14d、21d，极显著高于空白对照组（P＜0.01），酿酒酵母组和 Etp A组间无显著差异（P＞0.05）。灌服ETEC后，各组均出现下降，Etp A组极显著高于空白对照组和酿酒酵母菌组（P＜0.01）。
　　（3）Etp A酵母工程菌对肠道菌群pH的影响：实验第7~28d，酿酒酵母组和Etp A组的p H值呈下降趋势，在第21d，均显著低于空白对照组（P＜0.05），酿酒酵母组和EtpA组间无显著差异（P＞0.05）。灌服ETEC后，空白对照组pH值显著升高（P＜0.05），极显著高于酿酒酵母组和Etp A组，酿酒酵母组和 Etp A组间差异显著（P＜0.05）。
　　2. EtpA酵母工程菌对肠道黏膜免疫的影响：
　　（1）Etp A酵母工程菌对肠道黏膜结构的影响：①酿酒酵母组和EtpA组的小肠各段绒毛长度在7~28d均呈增长趋势，均于第28d达到最大值，其中空肠绒毛长度极显著高于空白对照组（P＜0.01），酿酒酵母组和 Etp A组间无显著差异（P＞0.05）。灌服 ETEC后，空白对照组和酿酒酵母组的空肠绒毛长度极显著下降（P＜0.01），与 EtpA组差异极显著（P＜0.01）。②酿酒酵母组和EtpA组的小肠各段绒毛宽度在实验中均无显著差异（P＞0.05）。③酿酒酵母组和Etp A组的空肠隐窝深度在第28d，显著低于空白对照组（P＜0.05），酿酒酵母组和Etp A组间无显著差异（P＞0.05）。灌服ETEC后，各组的空肠隐窝深度极显著升高（P＜0.01）， Etp A组极显著低于空白对照组和酿酒酵母组（P＜0.01）。④酿酒酵母组和Etp A组空肠、回肠V/C值均在28d达到最大最，且在第28d时空肠V/C值极显著高于空白对照组（P＜0.01），酿酒酵母组和 Etp A组间无显著差异（P＞0.05）。灌服ETEC后，空白对照组空肠 V/C值极显著下降（P＜0.01），且极显著低于酿酒酵母组和Etp A组（P＜0.01）；酿酒酵母组回肠V/C值显著下降（P＜0.05），且显著低于Etp A组（P＜0.05）。
　　（2）EtpA酵母工程菌对肠道黏膜中SIgA的影响：实验第7~28d，酿酒酵母组和EtpA组的SIgA含量呈上升趋势，于第21d达到最大值，均极显著高于空白对照组（P＜0.01），酿酒酵母组和Etp A组间无显著差异（P＞0.05）。灌服ETEC后，各组均极显著下降（P＜0.01），Etp A组极显著高于空白对照组和酿酒酵母菌组（P＜0.01）。
　　（3）EtpA酵母工程菌对肠道黏膜中重要细胞因子的影响：实验第7~28d，酿酒酵母组和EtpA组的IL-2、IL-4、IFN-γ呈上升趋势，在第14d，IL-2的相对增长倍数最大，与空白对照组差异极显著（P＜0.01）；从第14d起 IL-4、IFN-γ快速增长，在第21d、28d，均极显著高于空白对照组（P＜0.01），酿酒酵母组和Etp A组间无显著差异（P＞0.05）。灌服ETEC后，空白对照组和酿酒酵母菌组的IL-2、IL-4、IFN-γ均极显著变化（P＜0.01），IL-2、IL-4的含量极显著低于EtpA 组（P＜0.01），IFN-γ的含量极显著高于EtpA组（P＜0.01）。
　　综合以上结果得到以下结论：
　　1. EtpA酵母工程菌具有酿酒酵母的益生作用：能有效促进小肠黏膜的发育，加强肠道黏膜的吸收功能；丰富肠道菌群多态性，增加重要菌群数量；降低肠道菌群pH值；刺激肠道黏膜中重要免疫分子的分泌，加强肠道黏膜免疫功能。
　　2.从灌服第7d起随着灌服天数的增加，小肠各段绒毛长度、V/C值逐渐增加；肠道内有益菌群及重要细胞因子在第14d大幅度增加，而后缓慢增加；SIgA在第21d分泌量极显著增加，至第28d达到最高。
　　3. EtpA酵母工程菌发挥了大肠杆菌黏附素EtpA的免疫原性：当ETEC侵入机体时，能有效阻止ETEC的黏附，保护肠道黏膜结构的完整，维护肠道菌群的稳定，提高肠道黏膜免疫能力。

目录

声明

英文缩略词表

前言

第一章 EtpA酵母工程菌对肠道菌群的影响

1材料与方法

2结果

3讨论

4小结

第二章 EtpA酵母工程菌对肠道黏膜免疫的影响

1材料与方法

2结果

3讨论

4小结

结论

参考文献

发表著作

个人简历

致谢