欧洲型PRRSV、PCV2重组痘苗病毒候选疫苗规模化制备及其免疫研究

摘要

猪繁殖与呼吸综合征（Porcine Reproductive And Respiratory Syndrome，PRRS）是一种感染率高的猪传染病，严重影响着世界养猪产业。PRRS病毒分为欧洲型PRRSV（基因1型）以及美洲型PRRSV（基因2型），二者基因同源性相差40％左右。猪繁殖与呼吸综合征临床症状主要表现为母猪繁殖障碍，断奶仔猪普遍发生肺炎、生长迟缓以及死亡率增加。世界上很多国家一直应用弱毒疫苗和灭活疫苗来预防 PRRSV。但是，弱毒疫苗的应用，易造成病毒返祖，灭活疫苗则免疫原性一般很难有效的预防PRRSV。因此针对具有基因多样性特点的PRRSV，需要研发出一种安全有效的PRRS疫苗。我国PRRSV主要流行毒株为美洲型高致病性毒株，但近几年在我国多个省份相继分离到了欧洲型 PRRS毒株，欧洲型PRRSV的出现应该引起我们的关注。我国目前市面上的猪繁殖与呼吸综合征疫苗均为美洲型，美洲型的PRRS疫苗对欧洲型 PRRSV基本无交叉免疫保护性，因此需要研发出一种安全有效的欧洲型PRRS疫苗。
　　猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type2，PCV2）是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征（Post-weaning multisystemic wasting syndrome，PMWS）的主要病原。主要分为PCV-1和PCV-2两种血清型。加拿大1991年在世界范围内首次报道PMWS，到目前为止该病现已波及世界上很多国家，是被全球公认的危害养猪业的重要传染病之一，在中国PCV2在猪群中流行也十分严重。因此，研发一种安全有效的疫苗是解决PCV2流行问题的关键。
　　目的：本研究开展了欧洲型PRRSV、PCV2重组痘苗病毒候选疫苗的制备和免疫研究，通过利用微载体生物反应器技术制备实验室构建的欧洲型PRRSV、PCV2重组痘苗病毒疫苗，并通过猪体免疫实验对其免疫效果进行评价。
　　内容：
　　1.筛选出增殖能力强的种子细胞及种毒，建立种子细胞库及种病毒库。
　　2.通过细胞条件、感染条件、生产参数进行重组痘苗病毒疫苗制备条件优化。
　　3.通过微载体生物反应器技术建立分批式培养、半间歇式培养、灌注式培养三种生产工艺，进行欧洲型PRRSV、PCV2重组痘苗病毒疫苗的制备。
　　4.利用微载体生物反应器制备的欧洲型PRRSV、PCV2重组痘苗病毒疫苗进行猪体免疫研究。
　　方法：
　　1.种子细胞库及种毒库建立
　　通过细胞传代、细胞感染、滴度测定等方法，筛选出安全无致瘤性的BHK-21细胞及适合生产的欧洲型PRRSV、PCV2重组痘苗病毒rVTT-ORF2-EUO3O5毒株，建立种子细胞库及种毒库。
　　2.重组痘苗病毒疫苗制备条件优化
　　通过细胞条件优化和感染条件优化确定一套可用于细胞增殖和病毒扩增的生产控制条件。再通过研究温度、pH、转速等不同的调控参数在培养过程中对细胞和病毒收益的影响，进一步优化调控参数，为大规模细胞培养和病毒增殖提供有效的参数。
　　3.欧洲型PRRSV、PCV2重组痘苗病毒候选疫苗制备
　　通过结合重组痘苗病毒疫苗优化后的数据结果进行生物反应器生产工艺流程的制定，并通过生产过程中葡萄糖和乳酸中间的关系对细胞增殖的影响选出最佳生产工艺。并对生物反应器所制备疫苗进行质量检测，疫苗品质是否符合《中华人民共和国兽药典》第三部的要求。
　　4.欧洲型PRRSV、PCV2重组痘苗病毒候选疫苗猪体免疫研究
　　通过利用生物反应器制备的以欧洲型PRRSV经典株LV株的ORF3和ORF5基因以及PCV2的ORF2基因为基础构建的重组痘苗病毒（rVTT-ORF2-EU-O3O5）疫苗进行猪体免疫实验，检测其各项免疫指标，分析重组痘苗病毒疫苗的免疫效果。
　　结果：
　　1.通过致瘤性实验，证明了BHK-21种细胞的安全、纯净；通过种子细胞、种毒的产毒比较，验证了种细胞的增殖及产毒优势，达到了预期的目的；通过PCR鉴定、WB鉴定，证明了欧洲型PRRSV、PCV2重组痘苗病毒，可以表达外源基因，形态上与天然痘苗病毒无差异；通过筛选，成功建立了种子细胞库和种毒库，冻存种子细胞16株，冻存种毒10株。
　　2.通过细胞条件优化，最终确定以10%血清(Hyclone)浓度的DMEM培养基进行细胞阶段的培养基；通过感染条件优化，最终确定以0.1MOI的感染剂量和2%血清浓度的维持液作为病毒感染阶段的感染条件；通过生产参数优化，最终确定细胞增殖阶段参数：温度为37℃、pH=7.3及M=80r/min。感染阶段参数：温度为35℃、pH=7.1及M=40r/min。
　　3.通过利用微载体生物反应器技术建立了分批式培养、半间歇式培养和灌注式培养三种生产方式；根据营养物质及代谢物质对细胞增殖的影响，确定灌注式培养是最适合疫苗制备的生产工艺；本实验制备的欧洲型 PRRSV、PCV2重组痘苗病毒疫苗，质量符合《中华人民共和国兽药典》第三部疫苗标准。
　　4.通过猪体免疫实验，欧洲型PRRSV、PCV2重组痘病毒候选疫苗免疫组，均能在35d能够有效的诱导猪体产生特异免疫应答，且中和抗体效价可达1:18.表明重组痘病毒疫苗可以诱导机体产生体液免疫应答；欧洲型PRRSV、PCV2重组痘病毒候选疫苗免疫组细胞因子，T淋巴细胞增殖实验等结果显著高于野毒及PBS对照组，表明重组痘病毒疫苗可以诱导机体产生细胞免疫应答；攻毒保护实验中，疫苗免疫组体温显著低于对照组，且体温均低于40℃无发热临床症状表现。病毒载量和病理切片结果表明在病毒入侵时重组痘苗病毒疫苗可以提供良好保护性。
　　结论：
　　1.成功筛选出种子细胞和种毒，并建立了种子细胞库及种病毒库。
　　2.通过细胞条件优化、病毒条件优化及生产参数优化，确定生产过程中最优收益条件及参数。
　　3.建立了三种生产工艺，通过培养中各物质之间消耗代谢关系，确定灌注式生产工艺为生产方式进行疫苗制备。
　　4.通过疫苗猪体免疫实验，结果显示疫苗可以刺激机体产生体液免疫和细胞免疫应答，并在病毒入侵机体时提供良好的保护。

目录

声明

英文缩略词表

前言

第一章 种子细胞库及种毒库建立

1.1 材料

1.2方法

1.3结果

1.4 讨论

第二章 重组痘苗病毒制备条件优化

2.1 材料

2.2 方法

2.3 结果

2.4 讨论

第三章 欧洲型PRRSV、PCV2重组痘苗病毒的高效生产工艺研究

3.1 材料

3.2 方法

3.3 结果

3.4 讨论

第四章 欧洲型PRRSV、PCV2重组痘苗病毒猪体免疫研究

4.1材料

4.2 方法

4.3 结果

4.4 讨论

结论

参考文献

个人简历

参与课题

硕士期间投稿文章

致谢