PRRSV与PCV2的分子流行病学调查及其重组腺病毒疫苗实验免疫研究

摘要

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)已经成为中国流行比较严重的猪病之一，特别是2006年爆发的高致病性PRRSV，给养猪业造成了巨大的经济损失。目前国内PRRSV流行毒株仍以美洲型为主，但在2011年以后随着欧洲型毒株在国内密集报道，证实国内也存在欧洲型毒株流行。PCV2是无囊膜单链DNA病毒，可分为PCV2a、PCV2b、PCV2c和PCV2d四个亚型。PCV2是引起猪圆环病毒相关疾病的主要病原体，临床上常见PRRSV和PCV2混合感染，推测二者可能存在协同作用，导致猪死亡率增高。PRRSV和PCV2混合感染实验证实，PCV2复制增强可以导致PRRSV对肺组织损伤的严重性增强。
　　本研究首先对2015-2016年广西猪场PRRSV和PCV2的流行情况进行监测，并分析其遗传变异情况;然后利用腺病毒载体构建PRRSV和PCV2重组腺病毒候选疫苗;最后，利用小鼠和猪体对重组候选疫苗进行免疫评价。主要研究结果如下:
　　(1)对2015-2016年广西地区PRRSV和PCV2流行病学调查发现，2015年广西部分地区PRRSV和PCV2血清阳性率分别为63％-90％和85％-93％。对广西玉林市2014年-2016年PRRSV和PCV2跟踪调查发现连续三年的PRRSV抗体阳性率出现持续性下降。猪群体免疫不均匀或者免疫效果不佳更容易造成病毒变异，给疾病的预防和净化造成巨大的障碍。本研究发现7株PRRSV均属于美洲型高致病性毒株，且属于2个不同基因亚群。GXB11-2015分离株存在2处不连续150个核苷酸缺失，氨基酸缺失特征为1+20+29。获得27株PCV2全基因组序列，分析表明PCV2d可能成为中国广西猪场的优势毒株。重组分析发现3处基因重组现象，压力选择分析表明ORF2更容易受到阳性筛选。
　　(2)本实验以美洲型经典VR2332株和HP-PRRSV GD株的ORF3、ORF5基因，欧洲型代表株LV株ORF3、ORF5基因及PCV2 NM株ORF2基因为基础，利用穿梭质粒pacAd5 K-N pA，成功构建美洲型重组腺病毒rAd-NAORF3-ORF5、欧洲型PRRSV和美洲型PRRSV二价重组腺病毒rAd-EUORF3-ORF5-NAORF3-ORF5、美洲型PRRSV和PCV2二联重组腺病毒rAd-ORF2-NAORF3-ORF5、欧洲型PRRSV和PCV2二联重组腺病毒rAd-ORF2-EUORF3-ORF5以及含有IL18细胞因子的rAd-NAORF3-ORF5-IL18和rAd-EUORF3-ORF5-IL18，并对重组腺病毒进行筛选鉴定。
　　(3)小鼠免疫试验结果表明，ORF5和ORF3具有免疫协同作用，可以促进机体细胞免疫水平和体液免疫水平。IL18作为细胞因子佐剂可以促进腺病毒rAd-NA-ORF3-ORF5-IL18、rAd-EU-ORF3-ORF5-IL18、rAd-ORF2-IL18的免疫效果。PRRSV-PCV2二联重组腺病毒疫苗rAd-ORF2-NA-ORF3-ORF5、rAd-ORF2-EU-ORF3-ORF5能刺激小鼠细胞Th1类和Th2类细胞免疫反应。
　　(4)猪体免疫试验结果表明，PRRSV-PCV2重组腺病毒疫苗能诱导猪体产生较好的体液和细胞免疫反应。免疫第35天时rAd-EU-ORF3-ORF5-NA-ORF3-ORF5免疫组CD4+T淋巴细胞的水平显著高于野毒组1.46倍(P＜0.05)。LV株病毒攻毒后，野毒免疫组血液中的病毒载量高于rAd-NA-ORF3-ORF5-EU-ORF3-ORF53.5倍(P＜0.05)。攻毒保护实验表明，重组腺病毒疫苗能够提供有效的免疫保护，表明所构建的重组疫苗在抵抗PRRSV和PCV2病毒感染方面具有很好的发展潜力。
　　综上所述，我国的PRRSV和PCV2毒株不断发生新的变化，PRRSV外来毒株的及PCV2基因型的漂变给疾病的预防和控制带来巨大的挑战。本研究丰富了当前PRRSV及其PCV2分子流行病学资料;利用腺病毒载体构建欧洲型、美洲型PRRSV及其PCV2重组候选疫苗能够在小鼠和猪体免疫中诱导特异的体液和细胞免疫，攻毒保护实验证明可以提高对仔猪的保护水平，从而为PRRSV和PCV2基因工程疫苗的研究奠定了基础。

目录

声明

摘要

英文缩写对照表

前言

第一篇 文献综述

第1章 猪繁殖与呼吸综合征研究进展

1．1 基因分型

1．2 基因结构和复制

1．3 PRRSV感染

1．4 抗感染免疫反应

1．5 PRRSV感染对宿主免疫的影响

1．6 PRRSV疫苗的研究现状

第二章 猪圆环病毒研究进展

2．1 PCV2基因组结构

2．2 PCV2基因分型

2．3 PCV2感染与流行状况

2．4 PCV2感染后与免疫细胞因子间的相互作用

2．5 免疫保护

2．6 PCV2疫苗研究进展

第二篇 研究内容

第一章 新发猪病毒病流行病学调查及检测方法的建立

1．1 材料

1．2 方法

1．3 结果

1．4 讨论

1．5 小结

第二章 PRRSV和PCV2流行病学调查研究

2．1 材料与方法

2．2 方法

2．3 结果

2．4 讨论

2．5 小结

第三章 PRRSV-PCV2重组腺病毒候选疫苗构建

3．1 材料

3．2 方法

3．3 结果

3．4 讨论

3．5 小结

第四章 PRRSV-PCV2重组腺病毒候选疫苗小鼠免疫实验

4．1 材料

4．2 方法

4．3 结果

4．4 讨论

4．5 小结

第五章 PRRSV-PCV2重组腺病毒候选疫苗猪体免疫实验

5．1 材料

5．2 方法

5．3 结果

5．4 讨论

5．5 小结

第六章 结论

参考文献

附录

攻读学位期间发表的学术论文及取得的科研成果

导师及作者简介

致谢