发热伴血小板减少综合征病例的病毒载量与抗体动态变化规律研究

摘要

一．研究背景：
　　新型布尼亚病毒(Severe fever with thrombocytopenia syndrome virus，SFTSV)隶属于布尼亚病毒科白蛉病毒属，是一种新发蜱传病毒，能感染人并引起发热伴血小板减少综合征(Severe fever with thrombocytopenia syndrome，SFTS)。该病是近年来首先发现于我国中部农村地区的一种新发传染病。自2010年首例发现至今，已席卷中国大陆19个省份。周边国家日本和韩国也相继有零星病例报道。另外，有报道称美国从两例患者体内分离出的另一种隶属于白蛉病毒的Heartland病毒，该病毒的基因与SFTSV的基因极为相似。患者在被蜱虫叮咬后，潜伏期一般为5-12天。大多数患者起病急，其主要临床症状为高热（多数为持续性高热，严重的可达到40℃以上）、白细胞计数和（或）血小板计数减少。绝大多数患者预后良好，老年患者、合并慢性疾病者、免疫力低下者及诊断治疗不及时者，感染后病情危重。少数重症患者可因多脏器损伤而死亡，病死率在6.3％~30%之间波动。
　　目前，该病尚无有效的治疗手段。临床医生一般依靠患者的临床特征以及血常规和血生化检测结果，开展针对性治疗。高病毒载量和重症临床结局相关研究，部分诠释了病毒载量在患者预后中起到的重要作用。然而，关于SFTS患者在整个住院期间的病毒载量变化的研究却很匮乏。另一方面，针对 SFTSV感染患者在整个病程的免疫反应是增强还是被抑制依旧不清楚，SFTS患者的细胞和体液免疫反应与患者临床预后之间的关系研究很少。
　　二．研究目的：
　　掌握SFTS患者在整个住院期间的病毒变化规律，探讨影响病毒载量的因素及其与临床预后的关系。描述SFTS患者的免疫水平及其变化规律，分析患者免疫反应与疾病预后的关系。
　　三．研究方法：
　　对于符合SFTS疑似病例纳入标准的患者，开展流行病学问卷调查，收集临床资料信息。收集的血清标本（即患者整个住院期间收集的血清）进行核酸提取。使用荧光定量聚合酶链反应检测SFTSV，根据绘制的标准质粒曲线，对血清阳性标本病毒载量定量检测。
　　对于符合随访病例纳入标准的SFTS病例，填写随访调查表格。每次回访时，对参与者进行常规的血液检查（血生化和血常规检测等）。采集的血清标本，使用酶联免疫法检测方法进行IgM、IgG抗体效价测定。另外，在征得参与者同意后，采集5ml EDTA抗凝血，在6小时内进行淋巴细胞分离，用于淋巴细胞和淋巴细胞亚群的检测。
　　四．研究结果：
　　基于SFTS病例纳入标准，本研究于2013年4至11月在哨点医院共纳入了208例患者。患者发病第3天，病毒载量均值为3.79±2.38Log10copies/ml；发病第6天，病毒载量达到峰值，为4.29±2.59Log10copies/ml；发病第15天，病毒载量下降至2.13±2.16 Log10 copies/mL。患者入院第1天，检测SFTSV的阳性率为44.4%（4/9）；发病第3天，阳性检出率最高，达到82.5%（33/40）；发病第6天，减少至78.5%（117/149）；发病第12天，阳性检出率为57.5%（103/179）；发病第18天，阳性检出率降至55.6%（25/45）。
　　病毒载量的峰值与白细胞（White blood cell，WBC）的最低值出现在患者发病的第6天；血小板（Platelet，PLT）的最低值、谷草转氨酶（Aspartate aminotransferase，AST）、乳酸脱氢酶（Lactate dehydrogenase，LDH）和肌酸激酶（Creatine kinase，CK）的峰值滞后于病毒载量峰值3天，而谷丙转氨酶（Alanine transaminase，ALT）峰值滞后于病毒载量峰值6天。收集的标本PLT计数恢复正常水平时，仍有34.3%（47/137）的标本SFTSV检测为阳性。患者白细胞恢复正常时，55.6%（80/144）的标本可检测到SFTSV。而重要的生化指标AST、LDH和CK恢复正常范围时，SFTSV阳性检出率分别为30.8%（20/65）、34.8%（16／46）和50.7%（76/150）；SFTS患者WBC与PLT计数均恢复到正常范围时，仍有30.8%（20/65）患者的SFTSV检测为阳性。
　　对符合随访病例纳入标准的SFTS病例，于2011年5月至2014年4月，共纳入了298例患者。出院后，55名患者参与了长期随访，共收集标本438份。在SFTS患者发病6个月的回访时间里，观察患者出现血小板减少、白细胞减少和乳酸脱氢酶升高各有3例（5.9%），4例（7.8%）和1例（2%）。SFTS患者发病第4天，血清中可以检测到特异的IgM抗体，患者发病的第4周，IgM抗体滴度达到峰值，6个月后仍能低水平检出。SFTS患者发病的第4周，IgM抗体阳性检出率最高（79.4%，27／34）；随访第3个月，IgM阳性检测率为35%（14/40）；随访第6个月，IgM阳性检出率仅为10.9%（6/51）；随访进行到第9个月时，无IgM阳性标本检出。SFTS患者IgG阳性检出率在随访的第6个月最高（89.1%，49／55），特异性抗体IgG的滴度达到峰值；随访第9个月时，IgG阳性检出率为87.3%（48/53）；随访第18个月，阳性检出率为87.2%（41/47）；随访第30个月， IgG阳性检出率为84%（21/25）。对纳入病例的外周淋巴细胞亚群检测，发现患者在感染SFTSV的第1周出现T细胞、B细胞和NK细胞显著减少。SFTS重症病例的CD3 T细胞数量可减少至176.8 cells/mm3，其中，CD4可减少至66 cells/mm3，CD8可减少至63 cells/mm3。患者在感染SFTSV的第6周，各项外周血淋巴细胞亚群的计数均恢复至正常水平。
　　五．研究结论：
　　1.发热伴血小板减少综合征病例住院期间病毒载量的前瞻性研究
　　（1）入院时，55.6%患者SFTSV检测为阴性，提示临床医生在对病人进行临床诊疗过程中，仅依据一次RT-PCR检测结果是不妥的。基于RT-PCR检测SFTSV的诊断手段，在患者发病后的第3天再次进行SFTSV检测，其临床参考意义更可信，同时也可以避免误诊或漏诊的发生。
　　（2）SFTS患者发病第6天，患者体内病毒拷贝量达到峰值，造成人与人之间传播的危险最高。
　　（3）重症患者病毒载量的初始值和峰值远高于轻症患者，特别是入院时间间隔过长的高龄女性患者体内病毒载量更高，病毒排泄速度相对较慢。另外，5例死亡病例的病毒载量的峰值大于107copies/ml，这一数值可以作为阈值，预测患者发生死亡的可能。同时提示临床医生需及时采取临床措施，干预治疗。
　　（4）实验室检测参数WBC、PLT、AST、ALT、LDH和CK的异常变化与患者体内病毒拷贝量有一定的联系，可以作为临床医生诊断和病情分析的辅助参考。
　　2.发热伴血小板减少综合征病例免疫特征的前瞻性研究
　　（1）SFTS病例感染后第1周，其T细胞、B细胞和NK细胞显著减少，免疫系统受到严重损坏，患者体内产生针对SFTSV的特异性的IgG和IgM抗体不足，进一步加剧了患者病情的恶化。因此，在患者感染早期，针对性开展免疫功能相关治疗可改善患者预后。
　　（2）IgM和IgG抗体滴度在临床诊疗方面有着重要的应用。特异性的IgM抗体可在发病第4天检测到，第4周达到峰值，监测第6个月已经很难检测到。因此，在发病早期，这一规律可以用来判断病人是否已经存在病毒感染。IgG抗体在患者发病后第3周可以检测到，第6个月达到峰值。大多数随访患者的IgG抗体持续超过3年，提示患者如再次暴露于 SFTSV，已有的免疫水平可提供保护，防止其再次感染 SFTSV。同时，在未来开发出可用的SFTSV疫苗后，该研究结果可对疫苗的使用策略提供有效的参考。
　　(3)初始病毒载量偏高或免疫系统受损的患者，例如有基础疾病史的高龄患者，固有免疫严重抑制，其启动适应性免疫时间延长，导致病毒的清除迟缓。基于此研究，认为SFTSV可通过操纵和攻击启动抗病毒反应的细胞，弱化宿主免疫应答，抑制患者的细胞和体液免疫反应，从而导致临床症状加重。

目录

声明

缩略词表

前言

第一部分 发热伴血小板减少综合征病例住院期间病毒载量变化规律的前瞻性研究

引言：

1.材料

2.方法

3.结果

4.讨论

5.结论

第二部分 发热伴血小板减少综合征病例免疫特征的前瞻性研究

引言：

1.材料

2.方法

3.结果

4.讨论

5.结论

参考文献

附录

攻读学位期间发表的学术论文

个人简历

致谢