狂犬病病毒M蛋白在杆状病毒中的表达、纯化及生物学特性初步研究

摘要

狂犬病（Rabies）是由狂犬病病毒（Rabies Virus，RV）引起的一种人兽共患病。人和大多数温血动物易感，临床上以怕光，精神沉郁，进行性麻痹和最终死亡为主要特征，致死率几乎100％。RV有N、P、M、G和L共5种结构蛋白，其中，G蛋白是决定RV致病性的关键蛋白。许多研究表明G蛋白某些氨基酸位点的突变会改变RV的致病性以及病毒的一些生物学属性，如胞间扩散，膜融合，诱导细胞凋亡等。而RV其它蛋白对其致病性是否有影响却知之甚少。2006年， Shimizu K等人利用反向遗传学技术把Ni-CE（由固定毒株Nishigahara在鸡胚成纤维细胞中连续传100代后获得的，对成年小鼠无致病性）M蛋白基因替换成Nishigahara株（固定毒株，脑内接种可致死成年小鼠）M蛋白基因后，重组病毒CE（NiM）重新获得了致病力，脑内接种可致死成年小鼠。此结果为人们对RV致病机制的深入研究打开了新的篇章。因此，从多个角度进一步探讨M蛋白对RV致病性的影响对于明确RV的致病机制和有效防控狂犬病具有重要意义。
　　本研究以探讨单独的M蛋白接种对RV致病性的影响为目的，进行了如下试验：
　　1．表达狂犬病病毒M蛋白的重组杆状病毒的构建和鉴定。试验内容：①以RT-PCR技术扩增狂犬病病毒BD06株M蛋白基因；②将M蛋白基因序列插入杆状病毒载体质粒pFastBac I中，构建重组质粒pFastBac I-M；③用鉴定正确的重组质粒pFastBac I-M转化DH10 Bac E.coli感受态菌，构建重组穿梭质粒Bacmid-M，并以PCR法鉴定；④以脂质体Lipofectamine2000介导重组穿梭质粒Bacmid-M转染Sf9昆虫细胞，获取重组杆状病毒AcMNPV-M，取细胞病变上清，以电镜观察重组病毒形态；⑤用小鼠抗His标签单克隆抗体、兔抗RV阳性血清和犬抗RV阳性血清通过Western Blot方法鉴定重组M蛋白的表达及其反应原性。
　　2．重组M蛋白的纯化及多克隆抗体的制备。试验内容：①利用镍离子亲和层析柱纯化重组M蛋白；②用纯化的重组M蛋白免疫大耳白兔，每次免疫后1周，耳缘静脉采血并分离血清；③通过Western Blot试验分析兔抗M蛋白多克隆抗体同狂犬病病毒aG株、PV2061株、SRV9株、CVS-11株、ERA株和BD06株M蛋白之间是否存在交叉反应；④以FAVN试验测定兔抗M蛋白多克隆抗体是否具有病毒中和活性。
　　3．M蛋白生物学特性初步研究。以探索接种M蛋白后对脑内与外周攻毒小鼠潜伏期、发病率的影响为目的。具体试验步骤如下：①将实验动物随机分为脑内攻毒组和外周攻毒组两个大组，两组中又分别设立了高剂量攻毒组和低剂量攻毒组；②将纯化的M蛋白与等体积油佐剂混合后分别于0d，7d，14d通过腹腔注射免疫四个大组中的小鼠，同时大组内设立透析液组、AcMNPV组作为对照；③第3次免疫后，于第5天对小鼠进行断尾采血并分离血清，用Western Blot试验分析重组M蛋白免疫原性；④第3次免疫后1周，对两大组小鼠分别进行脑内和外周肌肉注射攻毒试验，攻毒后连续观察14天，记录小鼠攻毒后的潜伏期、发病数以及死亡数。
　　通过以上试验，获得以下结果：
　　1.成功构建了重组杆状病毒AcMNPV-M，且该重组病毒电镜下具有典型的杆状病毒形态，其感染Sf9昆虫细胞后，通过SDS-PAGE试验鉴定，重组杆状病毒表达了一约25kD的蛋白，用小鼠抗His标签单抗、兔抗RV阳性血清和犬抗RV阳性血清通过Western Blot试验对其反应原性鉴定，在25kD附近也出现了单一的条带。
　　2.变性条件下纯化的重组M蛋白SDS-PAGE条带单一，纯度良好；透析复性后，以该纯化M蛋白免疫大耳白兔制备的兔抗M蛋白多克隆抗体与现有主要狂犬病疫苗株及流行毒株M蛋白反应性能良好，Western Blot鉴定结果显示在25 kD左右均出现了一特异性条带；FAVN试验结果显示，兔抗M蛋白多克隆抗体的病毒中和效价为0。
　　3.小鼠攻毒试验结果显示，单独接种M蛋白后，脑内接种3 LD50或50 LD50狂犬病病毒CVS-24株时，不同小组动物的潜伏期、发病和死亡率均无明显差异；外周接种100 LD50狂犬病病毒BD06株时，AcMNPV-M组的小鼠全部发病，透析液组和AcMNPV组小鼠死亡率为80%（8/10）；外周接种3 LD50狂犬病病毒BD06株时，AcMNPV-M组、透析液组和AcMNPV组的小鼠均无发病。
　　通过以上研究结果，得出以下结论：
　　1.成功构建了重组杆状病毒AcMNPV-M，且该重组病毒表达的M蛋白具有良好的反应原性，为后续研究M蛋白其它生物学特性奠定了物质基础。
　　2.可用镍离子亲和层析法对杆状病毒表达的M蛋白进行纯化；重组M蛋白免疫原性良好；制备的兔抗M蛋白多克隆抗体与现有狂犬病疫苗株及流行毒株均有良好反应性；M蛋白诱导机体产生的抗体无病毒中和活性。
　　3.单独的M蛋白接种对不同组别中脑内攻毒小鼠的潜伏期、发病率和死亡率的均无明显影响；对不同剂量外周攻毒的小鼠的潜伏期也无明显影响，但有提升小鼠的发病率的趋势。提示单独接种M蛋白可能会影响狂犬病病毒致病性。
　　论文创新点：
　　1.利用杆状病毒表达系统成功表达了狂犬病病毒BD06M蛋白，建立了纯化方法，制备了抗M蛋白多克隆抗体，为深入研究M蛋白的生物学功能奠定了基础。
　　2.探索了单独的狂犬病病毒M蛋白接种对狂犬病病毒致病性的影响，为进一步明确狂犬病病毒致病机制提供了基础实验数据。

目录

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英文缩写词表

前言

第一章 狂犬病病毒M蛋白在杆状病毒中的表达及鉴定

1 材料与方法

2结果

3讨论

4.小结

参考文献

第二章 重组M蛋白的纯化及多克隆抗体的制备

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

4小结

第三章 狂犬病病毒M蛋白生物学特性的初步研究

1材料和方法

2结果

3讨论

4小结

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