细胞核环境对染色质高级构象的影响

摘要

细胞核是真核生物特有的细胞器，它主要由细胞核被膜、核纤层、细胞核基质、染色质及核仁五部分组成。其亚细胞器相互独立又相互关联，共同组成一个精密有序的有机整体。细胞核是遗传信息存储和复制的重要场所，作为调控细胞代谢、分化及遗传的核心中枢，在生命进程中发挥重要的功能。
　　染色质是真核细胞核中遗传物质的存在形式。由 DNA、组蛋白、非组蛋白及部分RNA等组成，是真核生物体内最大的单一生物大分子。
　　2m左右长的DNA被压缩组装到直径6微米的细胞核中，显示染色质经历了高度有序的折叠压缩。研究表明染色质是层次性有序折叠的。首先DNA缠绕在组蛋白八聚体核心中，形成核小体结构；其次以4个核小体为结构单元相互垛叠成左手螺旋的30nm结构；最后进一步地压缩形成致密的染色质结构。根据致密程度的差异，染色质可分为常染色质和异染色质。
　　染色体构象捕获技术3C（Chromosome Conformation Capture）的出现及其衍生技术4C、5C、Hi-C等的迅速发展，为染色质三维高级结构的研究带来了全新的机遇，开创了三维基因组这一全新的领域。高等动物基因组三维高级结构的5C和 Hi-C研究发现：染色质高级结构呈现分维构象，具有拓扑学相关结构域TAD（Topological Associated Domain），TAD是染色质高级构象结构和功能的基本单元。
　　染色质高级结构是分层级折叠的。在有丝分裂间期，不同染色体占据不同的相对独立但有又稳定的空间位置，形成染色质领域CT（Chromosome Territory），染色领域根据折叠程度的不同可以分为开放区域和密闭区域，这些区域则是由多个TADs相互聚集组成，TADs则可进一步分为拓扑学亚结构域Sub-TADs。分等级的染色质三维高级结构在细胞命运的稳定维持中发挥重要作用。
　　研究表明染色质总体高级结构特别是TADs在不同细胞维持稳定，物种之间相对保守，在单倍体精子细胞和二倍体成纤维细胞中，TAD仍然具有较高的一致性。但最近也有报道指出，染色质高级构象是可塑的，在环境的刺激下，TADs会作出应答并发生重构，提示作为染色质折叠的结构和功能单元，TADs具有折叠鲁棒性、稳定性和一定的弹性。
　　普遍认为真核生物中已知唯一的绝缘子蛋白CTCF是染色质构象的关键组织者，其在介导染色质远距离的相互作用、帮助建立和维持染色质三维高级结构等方面发挥重要的功能。但是染色质构象形成的具体分子机制等仍不是很清楚。染色质的折叠是否遵循自组织的原则根据其自身性质特别是DNA序列实现自我重构？不同细胞核环境对染色质折叠得影响如何？在新的核环境下染色质折叠能否自洽完成等问题目前都尚不得而知。
　　针对上述问题，本研究选用带有人21号染色体的动物模型TC1小鼠为研究材料，通过分析21号染色体在人细胞和鼠细胞染色质构象的异同，进而揭示细胞核环境对染色质高级构象的可能影响。
　　为了以较少的测序量获得高精度的21号染色体构象数据，本研究基于液相杂交捕获技术，建立了单染色体靶向富集的Capture Hi-C（cHiC）技术，利用生物信息学分析工具及算法，从全局互作、TAD比较、远距离互作、断裂位点、重排片段等五个层次进行了研究分析。
　　第一部分，为富集21号染色体特异性片段，减少测序量，我们建立了单染色特异性捕获方法。主要包括：正常核型的人胚肝细胞同步化到中期，低渗制备染色体悬液；利用流式细胞仪进行21号单染色体分选；采用MALBAC技术将21号染色体进行全染色体扩增；使用标准的建库流程制备可用以转录的DNA文库；采用T7 RNA转录酶进行RNA探针的制备；优化液相杂交体系，进行片段和文库的杂交捕获；用qPCR技术验证靶向片段和文库在捕获后的富集效率。结果表明单片段可以得到数百倍的富集，而文库的富集效率约为60倍。
　　第二部分，Capture Hi-C实验的具体流程及文库的质量控制。首先处死TC1小鼠，解剖获取新鲜组织，制备单细胞悬液；Hi-C实验制备杂交捕获模板，并利用NheI限制性内切酶进行Hi-C实验有效性等质控检测，结果表明Hi-C文库中嵌合片段的比例在70％以上，提示文库制备正常；利用制备的RNA探针进行杂交捕获；qPCR结果表明21号染色体上特定片段的捕获倍数达到约350倍。
　　第三部分，Capture Hi-C捕获片段的高通量序列测定、数据质控和生物信息学分析。捕获片段经过文库制备、PCR扩增等后，在Illumina平台使用125bp读长的Hiseq2500进行高通量序列测定，获得170M原始测序数据，数据过滤、比对分析后发现：Hi-C文库的嵌合片段占总的配对末端Reads数85%，表明Hi-C建库质量良好；而来自人21号染色体有效数据占总的Di-tags数据的10%，证实文库富集了近13.3倍；最后使用人21号染色体相互作用数据建模，获得了人21号染色体的互作图谱；由于在TC1小鼠中人21号染色体发生了重排，我们按照重排片段（包含重复和倒置）对TC1小鼠和人IMR90细胞中相应片段进行比较，发现重组片段内TAD得到了维持；断裂位点处染色体互作强度和两侧的互作频率的分析发现：在IMR90细胞和TC1重排的21号染色体中，而断裂位点一侧到另一侧的互作均要低于随机选取的对照位点，这表明染色体重排后，重排片段仍然倾向于片段内部相互作用。Hi-C数据中1%最强的互作分析发现，正常细胞中这些互作主要集中在1Mb的线性范围内，而TC1重排的人21号染色体中远距离强相互作用所占比例显著增强。
　　综上，围绕染色质的高级折叠是否遵循自组装的原则、细胞核环境是否影响染色质高级构象这一科学问题，我们利用含有人类21号染色体的TC1小鼠这一独特模型，通过单条染色体的流式分选、特异性的扩增、RNA捕获探针的制备、液相Capture Hi-C捕获以及捕获片段的高通量序列测定、互作片段的生物信息学分析等手段的综合应用。结果发现：人的21号染色体在小鼠细胞核环境下，其染色质折叠的基本单元TAD得到维持，而且重组断裂位点处一侧到另一侧互作弱于随机对照，提示重排重组片断更倾向于重组片断内部之间互作，初步表明染色质的折叠具有一定的自洽性；断裂位点区域互作强度低，暗示TAD可能作为染色质重排和演化的基本单元；此外，我们还发现在TC1小鼠的21号染色体中远距离的互作增强，暗示染色质结构变得更为松散。本研究为进一步探讨远距离互作、染色体重组等的分子机理及其生物学意义等奠定了基础，同时也为染色体进化等研究提供了一个很好的切入点。

目录

声明

缩略词表

第一章 前言

1.1细胞核结构

1.2染色质在细胞核的空间分布

1.3 染色体三维结构研究方法及相关研究进展

1.4染色质高级构象分层级折叠

1.5染色质高级构象的影响因素

1.6 染色质高级构象的稳定性

1.7细胞核环境对染色质高级构象的影响

第二章 单染色体特异性捕获方法的构建

引言

2.1 材料和方法

2.2 实验结果与分析

2.3 小结和讨论

第三章 Capture-Hi-C建库及文库质控

引言

3.1 实验材料和方法

3.2 实验结果与分析

3.3 小结和讨论

第四章 TC1小鼠细胞的Capture Hi-C测序数据分析

引言

4.1 结果与分析

第五章 结论

5.1 建立了基于单染色体液相杂交捕获的Capture Hi-C技术

5.2 获得TC1小鼠21号染色体互作图谱

5.3 在新核环境下重排大片段内部染色质构象得以维持

5.4 断裂位点具有边界效应

5.5 重排的21号染色体远距离强相互作用增强

参考文献

在学期间发表的代表性论著:利用CRISPR/Cas9技术构建CTCF蛋白降解细胞系

综述：单染色体靶向富集方法的建立

个人简历

致谢