SIRT1在阿霉素诱导的心肌毒性与线粒体功能紊乱中的作用

摘要

目的：
　　线粒体是阿霉素（Doxorubicin，DOX）心脏毒性作用的关键靶标，DOX诱导的心肌损伤的发生与发展与线粒体功能障碍密切相关。氧化物酶体增殖物受体γ共激活因子1α（PGC-1α）是维持线粒体功能的重要分子，其介导的线粒体新生是维持线粒体数量平衡、保证线粒体正常功能的重要活动。DOX引发心脏毒性时会出现PGC-1α下调、线粒体新生障碍和线粒体功能紊乱，提示PGC-1α及其介导的线粒体新生障碍和线功能紊乱与DOX心肌毒性密切相关，但其具体调控方式和作用机制均不清楚。沉默信息调节因子2相关酶1（silent information regulation2 homolog1，SIRT1）是一种组蛋白去乙酰化酶，是PGC-1α去乙酰化激活酶。有研究发现SIRT1缺失会导致PGC-1α乙酰化水平升高和活性降低，加剧心肌线粒体损伤，提示SIRT1去乙酰化修饰是PGC-1α及与其相关的线粒体功能的重要调控机制。本研究假设SIRT1通过PGC-1α去乙酰化修饰和线粒体功能调节发挥其抗DOX心肌毒性作用。希望阐明DOX心脏毒性中SIRT1/PGC-1α在线粒体功能调节中的相互关系和作用特点，为深入探索DOX心脏毒性新机制、临床毒副作用防治提供新思路。
　　方法：
　　1.本研究首先对考察了SIRT1激活（激活剂RSV）或抑制（siRNA基因敲降）条件下，DOX所致细胞毒性、线粒体新生障碍和线粒体功能的变化，论证SIRT1在DOX所致心肌线粒体毒性作用机制中的重要靶标作用。SIRT1激活研究选择了表征线粒体功能的指标，如采用流式细胞检测法检查细胞ROS和超氧化物含量、荧光显微成像技术检查线粒膜电位、试剂盒检查ATP含量、CS活性等指标。同时还考察了反映线粒体新生的一系列指标，如Real-Time PCR检查mtDNA拷贝数变化、荧光显微成像技术检查线粒含量、Western blot检查PGC-1α介导的新生通路蛋白表达；并利用试剂盒检测了SIRT1酶活性、IP和Western Blot方法检查了SIRT1蛋白表达及PGC-1α的乙酰化水平变化，以考察SIRT激活对整个细胞和线粒体新生和功能的有益作用。随后利用siRNA瞬时转染构建SIRT1敲降细胞模型。利用该SIRT1敲降细胞考察DOX对细胞毒性、线粒体功能和新生的影响，分别考察了线粒体功能指标如细胞ROS、MMP、ATP含量，线粒体新生指标如mtDNA拷贝数、线粒体含量等，以论证SIRT1在维持正常细胞和线粒体功能、线粒体新生中的关键作用。
　　2.本研究随后考察了SIRT1在EPO发挥心脏保护中的关键作用。通过Western blot初步确定EPO对SIRT1有激活作用后，对EPO的保护效果与SIRT1是否有关进行考察。通过流式细胞术检测线粒体内超氧化物含量、JC-1染色荧光酶标法测定MMP以观察EPO抗DOX线粒体功能损伤作用；通过Western blot考察线粒体新生通路PGC-1α、NRF1、TFAM蛋白表达、线粒体内参蛋白VDAC、COXIV蛋白表达、PCR检测mtDNA拷贝数变化以观察EPO抗DOX线粒体新生障碍的作用。还着重检测了EPO抗DOX引起的SIRT1酶活性和蛋白表达降低以及PGC-1α乙酰化水平升高。为进一步确定EPO的抗DOX毒性作用依赖于SIRT1存在，再次利用SIRT1敲降细胞进行实验，选择线粒体功能指标如线粒体超氧化物含量、ATP含量和MMP；线粒体新生指标如新生通路相关蛋白表达进行考察。
　　3.最后本研究比较了单次给药和重复给药对细胞存活率和 SIRT1/PGC-1α通路的影响。首先根据BMD（基准剂量法）利用BMDS2.5.0软件拟合细胞生存率曲线，比较低剂量重复给药后的细胞与单次给药细胞的IC50和存活率BMDL值的变化；接着用Western blot检测相同累积剂量不同给药频率单次给药和重复给药细胞SIRT1/PGC-1α通路蛋白表达的不同。
　　结果：
　　1.SIRT1在RSV抗DOX毒性中的关键作用。
　　实验结果显示，DOX对AC16细胞生存率、线粒体新生和功能、SIRT1去乙酰化酶活性都有明显抑制作用。而 RSV能够显著提高同等 DOX剂量下心肌细胞的存活率，改善线粒体功能，如降低ROS生成、改善MMP降低、CS活性抑制。RSV还能改善DOX对线粒体新生通路的抑制，逆转阿霉素引起的线粒体DNA拷贝数降低，增强线粒体新生，增加线粒体数量。同时Western Blothe和IP结果也显示，DOX引起的SIRT1活性降低和PGC-1α乙酰化水平的升高均受RSV的保护而发生明显改善。同时，SIRT1敲降则加剧DOX对线粒体新生、线粒体结构和功能的影响。SIRT1敲降细胞在相同DOX给药下存活率更低、线粒体DNA拷贝数和线粒体含量也降低更多，提示SIRT1表达降低会引起线粒体新生障碍。荧光显微成像结果也显示SIRT1敲降加剧了DOX导致的线粒体MMP的降低、ATP合成降低和ROS堆积，线粒体功能受到更加严重的破坏。RSV的保护作用也因为SIRT1敲降而显著削弱。
　　2.EPO抗DOX心脏毒性新机制与SIRT1的关系。
　　实验首先确认AC16细胞中EPOR的存在及EPO对SIRT1的确具有激活作用。接着实验考察了给药24 h的DOX引起AC16细胞毒性和线粒体功能障碍，以及EPO的保护作用。EPO能够显著改善DOX引起的AC16细胞生存率降低、线粒体功能障碍和线粒体新生障碍，如缓解DOX线粒体内超氧化物堆积、SOD和CS表达降低以及MMP降低。同时，Western Blot和Real-time PCR结果显示EPO还能够显著改善 DOX引起的线粒体新生抑制，表现为缓解 DOX造成的PGC-1α通路相关蛋白表达下降、mtDNA拷贝数降低、SIRT1和PGC-1α的mRNA表达降低。DOX造成的SIRT1蛋白表达和活性抑制、PGC-1α乙酰化水平的升高，均由于EPO的保护作用发生显著改善。同时，SIRT1敲降细胞在相同DOX给药剂量下也表现出更大的细胞毒性、更严重的线粒体新生和功能障碍，具体表现为mtDNA拷贝数降低更多，超氧化物生成量增加、ATP含量、MMP等指标均较未敲降细胞降低更多，且EPO的保护作用也因为SIRT1的敲降而遭到明显削弱。提示EPO的保护作用依赖SIRT1存在。
　　3.单次给药与重复给药对细胞重要指标的影响。
　　方案A低剂量重复给药后的细胞与单次给药细胞的IC50和存活率BMDL值进行比较，发现低剂量重复给药3天的细胞较单次给药细胞对DOX毒性的耐受力显著提高，表现为IC50值和BMDL增大；而相同低剂量重复给药6天的细胞则较单次给药细胞对DOX毒性作用的耐受力显著降低，表现为IC50和BMDL降低。方案B相同累积剂量不同给药频率单次给药和重复给药细胞SIRT1/PGC-1α通路蛋白表达结果进行比较，发现相同累积给药剂量下，重复给药导致SIRT1、PGC-1α及线粒体新生通路蛋白表达与单次给药相比呈现显著差异，重复给药较单次给药所造成的蛋白表达抑制更加严重。
　　结论：
　　1.SIRT1是DOX毒性作用关键靶标，也是保护药物抗DOX毒性作用的潜在活性靶点。
　　本研究展示了已知的SIRT1激动剂RSV和保护机制未知的EPO在抗DOX心肌毒性中所表现出相似的对SIRT1激活、对线粒体功能和线粒体新生的促进作用，发现该保护作用均表现为对SIRT1的依赖性。在DOX引起的心肌毒性中，SIRT1由于其脱乙酰酶活性受到抑制而对线粒体新生通路产生扰动，造成线粒体新生及线粒体结构、功能障碍；而SIRT1激活剂则能够明显对抗DOX引起的线粒体毒性，维持心肌细胞结构和功能的相对稳定。因此SIRT1有可能成为防治DOX心肌毒性的重要靶点，具有SIRT1激活作用的药物有希望作为DOX联合用药的保护药，减轻DOX临床毒副作用，具有临床现实意义。此外，SIRT1作为一种线粒体毒性通路关键分子，通过其自身活性变化和对目标分子的翻译后修饰调节，在维持心肌细胞正常生理功能中发挥重要作用；以此引申到其他翻译后修饰作用，也具有成为新的毒性作用靶标和治疗靶标的潜力和前景，这对于探索药物毒性作用新机制、寻找有效保护药物具有重要的现实意义。
　　2.体外实验DOX单次给药和重复给药对生存率和蛋白表达产生不同影响。
　　重复给药较单次给药引起细胞对DOX的IC50、生存率BMDL发生显著偏移；SIRT1/PGC-1α通路蛋白表达发生显著差异。提示单次给药和重复给药有可能涉及不同分子机制，需要进一步的详细全面的论证和更为深入的研究。

目录

缩略词表

第一章 前言

1. DOX心脏毒性严重限制其临床应用，线粒体是其毒性作用重要靶标

2. 线粒体新生的重要性及其调控机制

3. SIRT1对心血管系统的保护作用机制与线粒体功能调节密切相关

4. SIRT1介导的PGC-1α去乙酰化修饰在心血管保护作用

5. 本研究的立足点和科学假说

6. 本研究的展开思路和希望解决的科学问题及意义

第二章 SIRT1在RSV抗DOX心脏毒性中的作用

2.1 材料与方法

2.2. 结果

2.3. 讨论

2.4. 本章小结

第三章 EPO抗DOX心脏毒性机制：SIRT1的激活及线粒体功能调控

3.1 材料与方法

3.2. 结果

3.3. 讨论

3.4. 本章小结

第四章 DOX重复给药对细胞生存率和SIRT1通路的影响

4.1 材料和方法

4.2 结果

4.3 讨论

4.4 本章小结

全文总结

应用前景与展望

参考文献

致谢