贝氏柯克斯体质粒生物学作用与功能研究

摘要

贝氏柯克斯体（Coxiella burnetii，简称Cb）是一种革兰氏阴性、专性胞内寄生菌，是引起人类Q热的病原体[1-3]。Cb主要通过气溶胶[4]、蜱虫叮咬等途径，在人与动物之间进行传播，是已知的感染性最强的病原体之一，也是一种潜在的生物战剂[5]和生物恐怖剂[6]。
　　研究发现：已知的Cb分离株中均含有一种质粒（QpH1[7]、QpRS[8]、QpDG[9]、QpDV[10,11]）或者整合到Cb基因组的质粒同源序列（IPS[8,12]）；Cb质粒编码多个IV型分泌系统效应蛋白[13,14]，这些蛋白分泌到宿主细胞质后，参与调控细胞功能[15]。长期以来，Cb质粒（包括IPS）被认为可能是菌体生长或胞内寄生所需的关键因子，又或者可能跟Cb的环境耐受和所引起的疾病种类（急性Q热或慢性Q热）相关。由于培养困难及缺少Cb质粒的遗传操作方法，Cb质粒及其编码基因的生物学功能和致病机制均缺乏研究。近年来，无生命培养基ACCM[16,17]培养Cb方法的建立，推动了Cb的遗传学研究进展，为研究Cb基因的功能创造了机遇。
　　本论文参考国外已有的Cb遗传操作方法[18,19]，通过基因工程技术构建Cb穿梭载体，建立了Cb的遗传转化方法；利用质粒相似不兼容机制[20-22]，成功构建了Cb內源质粒QpH1缺失突变体，并在体内、外对Cb质粒缺失突变体的表型和毒力变化等进行了初步的探讨；利用基因敲除和定点突变等技术，对Cb內源质粒QpH1的复制与分裂调控区进行了深入的探讨。
　　第一章，基于E.coli质粒pMMB207[23]，构建含RSF1010 ori的贝氏柯克斯体自主穿梭载体，建立贝氏柯克斯体转化系统。首先，利用PCR技术分别扩增绿色荧光蛋白基因（eGFP）、卡那霉素抗性基因（KanR）、Cb组成型表达基因启动子P311和P1169四段序列，以及含RSF1010 ori的载体骨架p207；然后，用融合PCR技术将四段序列融合为“P311-eGFP-P1169-KanR”串联序列；最后，用限制性核酸内切酶Kpn I和Xho I酶切“P311-eGFP-P1169-KanR”串联序列，连接至同样双酶切的载体骨架p207上，构建穿梭载体p207GK。将穿梭载体 p207GK电转化至Cb Grita II相株，用无生命培养基ACCM-2进行连续传代培养，利用倒置荧光显微镜观察eGFP基因的表达，传代至eGFP基因高表达时，用单层半固体“ACCM-2/Kan/琼脂”平板克隆分纯Cb转化株；结果成功构建了自主的Cb穿梭载体，获得了稳定表达eGFP的Cb转化株，并完成了克隆分纯。表明我们成功建立了Cb遗传转化系统，为后续用遗传学方法研究Cb奠定了基础。
　　第二章，生物信息学分析本室Cb Grita II相株质粒全长序列，确定该质粒为QpH1（GeneBank Accession No.AE016829），BLAST比对分析发现该质粒的CBUA0036～CBUA0039a序列片段在IPS中缺失，但在4种质粒（QpH1，QpRS，QpDG，QpDV）中存在且高度保守，推测该段序列可能是调控Cb质粒复制与分裂的功能区，包含复制起始位点序列和相关质粒分裂调控蛋白基因。利用PCR扩增技术，从质粒QpH1上扩增获得包含CBUA0036～CBUA0039a序列的片段，作为同源型质粒的骨架（命名为pQ）；同时利用融合PCR扩增技术，使 eGFP基因、KanR基因、P311和P1169启动子，以及pUC ori序列融合，形成“P311-eGFP-P1169-KanR-pUC ori”串联序列；把串联序列亚克隆至载体骨架pQ上，构建新型穿梭载体pQGK。将新型穿梭载体pQGK电转化至Cb Grita II相菌中，用含Kan的无生命培养基ACCM-2进行连续传代培养，通过荧光显微镜进行观察。结果发现新型穿梭载体pQGK能在Cb中稳定地传代，荧光激发下使Cb转化菌呈现绿色荧光，这说明新型穿梭载体pQGK上的CBUA0036～CBUA0039a序列片段含有pQGK质粒的复制起始位点序列（ori）。对转化菌克隆分纯后，用QpH1质粒特异性引物对Cb克隆株进行PCR鉴定，未能检测到QpH1质粒，说明Cb克隆株中的QpH1质粒已经丢失，获得了Cb內源质粒QpH1缺失突变株CbGrita II/pQGK；利用SYBR Green绝对定量Q-PCR技术分别测定Cb野生株中QpH1质粒和突变株Cb Grita II/pQGK中pQGK质粒的相对拷贝数，发现QpH1与pQGK质粒都只有单拷贝；以上数据说明QpH1与pQGK质粒具有相同的复制与分裂调控机制，两者在Cb中不能共存，表明CBUA0036～CBUA0039a这段序列能严格地调控质粒QpH1的复制、分裂及相似不兼容。用Q-PCR技术测定突变株Cb Grita II/pQGK在细胞外（ACCM-2）和细胞内（BGM）的增殖能力，发现突变株和野生株无论是在囊泡形成与生长，还是在Cb菌体增殖方面，均无明显无差别，这结果提示Cb质粒QpH1的大部分序列（CBUA0001～CBUA0034a，＞85％）与Cb在胞内和胞外的正常生长无关。通过体内（SCID小鼠）和体外（THP-1细胞）实验发现突变株的毒力下降，提示QpH1质粒是Cb的一个毒力因子。
　　第三章，以穿梭载体pQGK为基础，深入探索CBUA0036～CBUA0039a这段序列调控QpH1质粒复制和分裂的机制。通过基因敲除或序列删除的方法，对穿梭质粒pQGK上的CBUA0036～CBUA0039a这段序列进行不同程度地删减，构建一系列穿梭载体pQGK的突变体，命名为pQGK-D1～pQGK-D17。将这些穿梭载体分别电转化至Cb Grita II，用含Kan的ACCM-2培养基进行连续传代培养，通过荧光显微镜进行观察，当eGFP基因高表达时，对Cb转化菌进行克隆分纯；之后对Cb克隆株进行PCR鉴定分析。结果发现只有14个穿梭载体（pQGK-D1～pQGK-D14）能成功转化Cb并稳定传代；序列比较分析显示，只需含最短为600 bp的序列（介于CBUA0036和CBUA0037之间）即可使穿梭载体pQGK-D14在Cb内稳定地传代，而含更短序列片段的穿梭载体（pQGK-D15～pQGK-D17）无法获得Cb转化菌，说明这段600 bp的序列包含Cb质粒QpH1的复制起始位点序列（ori）。随后对已经克隆分纯的Cb克隆菌进行PCR鉴定，发现穿梭载体pQGK-D1和pQGK-D5均能敲除Cb Grita II内源质粒QpH1；穿梭载体pQGK-D7～-D8、pQGK-D11～-D14与QpH1质粒共存，到目前为止，以上结果表明QpH1质粒的复制、分裂和相似不兼容，除了复制起始位点（ori）外，还受到其它未知因子的调控（实验进行中，详细结果待补充）。
　　第四章，在前期研究的基础上，利用基因克隆技术，把穿梭载体pQGK上的KanR基因替换成RifR基因，构建新型穿梭载体pQGR，并电转化Cb Grita II及克隆分纯。在ACCM-2培养基中培养时，发现在相同时间内，pQGR转化株Cb Grita II/pQGR的增殖能力比pQGK转化株Cb Grita II/pQGK要明显下降；感染BGM后，结果发现在胞内只能形成细小的空泡，未能进一步发展成经典的大空泡，且Cb菌体增殖能力明显下降；感染THP-1细胞后，无空泡形成，亦未能检测到Cb菌体在细胞内增殖。上述结果说明，RifR基因的表达产物ADP-核糖基化酶在Cb内可能具有核糖基化作用，影响Cb正常的生物合成，使Cb减毒，对Cb感染细胞后空泡的发展和菌体增殖具有显著的抑制作用，表明RifR基因不适合作为Cb遗传转化研究中的药物筛选标记。
　　综上所述，本研究成功构建了基于RSF1010 ori的自主穿梭载体p207GK，并利用该穿梭载体建立了Cb的遗传转化系统；随后，成功构建了与Cb质粒QpH1具有同源序列（CBUA0036～CBUA0039a）的新型穿梭质粒pQGK，并利用该穿梭载体成功敲除Cb内源质粒QpH1，获得QpH1质粒缺失突变体；对CBUA0036～CBUA0039a这段序列进行深入的研究后，发现QpH1质粒的复制起始位点序列区；此外，实验过程中还发现RifR基因编码产物ADP-核糖基化酶对Cb的生物合成具有显著的影响，不适合用来作为Cb遗传转化的药物筛选标记。本研究为进一步深入研究Cb质粒的生物学功能和致病机制提供新的遗传学工具和方法。

目录

声明

缩略词表

前言

1 贝斯柯克斯体的发现

2 贝斯柯克斯体的培养

3 贝斯柯克斯体遗传转化方法的建立及应用

4 贝斯柯克斯体内源质粒的研究

5 贝斯柯克斯体内源质粒的功能

6 本课题研究的意义

第一章 贝氏柯克斯体穿梭载体构建与转化方法建立

引言

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第二章 贝氏柯克斯体内源质粒缺失突变体的构建及表型鉴定

引言

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第三章 贝氏柯克斯体内源质粒QpH1复制与分裂调控区的遗传学研究

引言

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第四章 利福平在贝氏柯克斯体遗传转化研究中的探索应用

引言

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

结论

参考文献

在学期间发表的代表性论著

个 人 简 历

致谢