基于SWATH-MS技术的肝癌定量蛋白质组学和激酶组学研究

摘要

肝癌是世界范围内常见恶性肿瘤，在我国居癌症死因第二位，具有生存期短、死亡率高等特征。肝癌诊断标志物和药物靶标的发现仍是该研究领域亟待解决的难题。多个信号通路与肝癌的发生发展密切相关，且各信号通路之间存在相互关联，形成一个复杂网络。对整个信号通路网络蛋白质组和激酶组变化的研究有助于探索肝癌的发病机制，找到潜在的灵敏、特异性高的肝癌诊断标志物和药物靶标。
　　在我国乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus,HBV）感染是引发肝癌的最主要因素，本课题从定量蛋白质组和激酶组视角切入，主要关注对HBV相关肝癌发生发展起重要作用的蛋白质组和激酶组变化。采用SWATH-MS（按窗口顺序采集所有理论质谱谱图，Sequential window acquisition of all theoretical mass spectra）非标记定量方法和多种小分子抑制剂亲和富集激酶相结合的化学蛋白质组技术，对临床标本（肝癌及癌旁组织）蛋白质组和激酶组进行全景式定量表征，遴选表达量差异显著的蛋白质和激酶；进一步运用蛋白质印迹法进行临床样本确证，为探索肝癌发生发展的分子机制、发现潜在的肝癌诊断和药物靶向标志物提供研究线索。
　　SWATH-MS技术是目前一种先进的非标记定量蛋白质组技术，可规避传统蛋白质组定量方法对于低丰度蛋白的定量偏差，具有样品用量少、样品前处理简单、蛋白鉴定覆盖率高和定量准确等优点，适合临床样本分析。本课题应用SWATH-MS技术对肝癌和对应癌旁组织的蛋白质组进行了比较研究，共定量4,216种蛋白质，其中338种蛋白质的表达量在肝癌和癌旁组织中有显著差异，包括191种蛋白质表达量在肝癌组织中增加，147种蛋白质表达量在肝癌组织中减少。对差异蛋白质的 KEGG通路分析提示，表达量在肝癌组织中显著变化的蛋白质参与了多种不同的信号通路。本文重点对参与代谢通路的差异蛋白质进一步分析，结果表明，在肝癌组织中高表达蛋白质主要涉及糖酵解途径、磷酸戊糖途径和脂肪酸生物合成途径；在肝癌组织中低表达蛋白质主要涉及糖异生途径，丝氨酸、甘氨酸和肌氨酸生物合成/代谢和脂肪酸-氧化途径。这些代谢通路变化共涉及二十七种关键酶分子，包括PCK2、PDH和G6PD等。本研究定量的表达差异蛋白质将为肝癌药物靶标或诊断性标志物的发现提供重要线索。
　　为定量研究肝癌组织样品中激酶的表达变化，本文运用化学蛋白质组技术，将丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂Purvalanol B和受体酪氨酸激酶抑制剂SU6668与EAH Sepharose4B固相偶联，或将高效广谱激酶抑制剂VI16832与 ECH Sepharose4B固相偶联，富集激酶，然后结合非标记定量SWATH-MS技术，对肝癌组织与对应癌旁组织的激酶进行定量分析，共定量383种激酶，其中有93种激酶在肝癌和癌旁组织中表达量差异显著，包括80种表达量在肝癌组织中增加的激酶和13种表达量在肝癌组织中减少的激酶。93种差异显著激酶中有蛋白激酶73种，在人类激酶组9类激酶中均有分布。此外，本研究激酶组数据显示，表达量在肝癌组织中显著变化的激酶涉及了多条信号通路，主要包括MAPK信号通路、PI3K/Akt/mTOR信号通路、VEGF信号通路、Wnt信号通路和Hedgehog信号通路，VEGFR-2、CDK6和mTOR等参与了这些重要的信号通路。这些结果表明，多种小分子抑制剂亲和富集激酶结合SWATH-MS非标记定量的化学蛋白质组技术，能够有效的找到可能参与肝癌发生发展的关键激酶。
　　此外，本课题对参与肝癌复杂信号通路网络的关键差异激酶及其小分子激酶抑制剂（Small-molecule kinase inhibitors,SMKIs）进行了文献调研。除已经被美国食品药品监督管理局（Food and drug administration,FDA）批准用于肝癌治疗含VEGFR-2靶点的多靶点小分子激酶抑制剂sorafenib外，以VEGFR-2为靶点用于肾细胞癌和甲状腺癌治疗的小分子激酶抑制剂 lenvatinib，以及其他含VEGFR-2靶点的用于其他癌症治疗的多靶点小分子激酶抑制剂如pazopanib、vandetanib、axitinib、regorafenib、cabozantinib、ponatinib和nintedanib均有可能成为潜在的肝癌治疗药物。同时，以CDK4和CDK6为作用靶点用于乳腺癌治疗的小分子激酶抑制剂palbociclib和刚批准的ribociclib，以及以mTOR为靶点用于肾细胞癌治疗的小分子药物sirolimus、temsirolimus和everolimus，也均可能成为潜在的肝癌治疗药物。因此，应用小分子激酶抑制剂富集激酶和非标记定量SWAHT-MS技术相结合的化学蛋白质组学技术，开展肝癌差异激酶组的研究，不仅可为肝癌治疗药物靶标的发现提供基础，也可为探索肝癌生物机制和治疗提供新的策略。
　　总之，本课题运用SWATH-MS技术对临床标本（肝癌及癌旁组织）蛋白质组和激酶组进行了全景式定量表征，定量了一批可能对肝癌发生发展起重要作用的差异蛋白质和激酶，为肝癌药物靶标或诊断性标志物的发现提供了重要数据，为探索肝癌治疗提供新的思路。

目录

声明

缩略词表

第一章 前言

1.1 研究背景与意义

1.2 肝癌肿瘤标志物的研究现状

1.3 肝癌蛋白质组学和激酶组学研究现状

1.4 本文研究内容

第二章 肝癌组织差异蛋白质组学研究

2.1 实验材料

2.2 实验方法

2.3 结果

2.4 讨论

2.5 小结

第三章 基于化学蛋白质组学技术的肝癌差异激酶组研究

3.1材料和方法

3.2 实验方法

3.3 结果

3.4 讨论

3.5 差异激酶组研究对肝癌治疗的意义

3.6 小结

第四章 结论与不足

4.1 结论

4.2 不足

参考文献

附录

个人简历

致谢