趋化因子CCL2和长链非编码RNA AVAN抗流感病毒作用机制研究

摘要

流感是危害人类健康的重要呼吸道传染病，曾多次引起全球暴发流行，夺走数千万人生命。流感病毒感染容易造成急性肺损伤（acute lung injury，ALI），严重者可出现急性呼吸窘迫综合症（acute respiratory distress syndrome，ARDS），最终导致死亡。研究表明，急性肺损伤的产生，一方面是由于病毒本身，另一方面是由于感染引起的过度免疫反应导致的“细胞因子风暴”（cytokine storm）。随着研究的深入，许多和流感病毒感染导致急性肺损伤密切相关的细胞因子和趋化因子被发现，但其功能一直存在争议，并且在禽流感病毒感染中报道甚少，特别是H7N9禽流感病毒介导的急性肺损伤，至今未见报道。
　　随着二代测序技术的发展和广泛应用，越来越多的长链非编码RNA（long noncoding RNA，lncRNA）被发现和认识，其在生命活动中发挥着重要作用，如肿瘤的发生发展、个体发育、神经科学等。在抗病毒天然免疫反应过程中，虽也有少数有功能的lncRNA被发现，但仍存在着大量功能未知的lncRNA，特别是中性粒细胞lncRNA表达谱，至今未见报道。我们设想找到一条lncRNA，可在抗病毒天然免疫反应过程中发挥重要的作用。
　　基于以上研究背景，我们拟从趋化因子和长链非编码RNA功能和机制为切入点，分别从蛋白水平和RNA水平，探讨天然免疫反应在甲型流感病毒感染导致的急性肺损伤中的作用，开展以下两部分研究：
　　一、趋化因子CCL2在甲型 H7N9禽流感病毒介导的急性肺损伤中的作用研究
　　为了建立甲型H7N9禽流感病毒介导的急性肺损伤的小鼠模型，我们首先利用H7N9禽流感毒株（Ah01株和Hb01株）感染C57BL/6小鼠，从小鼠体重变化和死亡率结果来评价感染效果，结果显示Hb01株毒力较Ah01株强，能够使小鼠体重显著下降，并快速诱导小鼠死亡。我们进一步分析了小鼠肺部病理改变和肺部水肿程度，发现Hb01株H7N9禽流感病毒能够有效诱导小鼠产生急性肺损伤，因此我们选择 Hb01株 H7N9禽流感病毒感染小鼠模型为后续研究模型。在建模过程中，我们发现H7N9感染后小鼠的死亡高峰基本在一周出现，与文献报道的H5N1感染后小鼠死亡情况相似，这提示天然免疫同样在H7N9感染导致小鼠死亡的过程中发挥着重要作用。利用获得性免疫缺陷小鼠（Rag1-/-小鼠）感染H7N9模型，结果显示Rag1-/-小鼠感染H7N9后表现出和野生型几乎相同的死亡率、体重变化以及肺部病理变化，这进一步表明H7N9感染导致小鼠主要在天然免疫阶段。
　　为了研究H7N9感染后小鼠的高细胞因子血症，我们收集了H7N9感染后第5天小鼠的血清和支气管肺泡灌洗液，进行细胞因子和趋化因子表达谱分析，结果显示大部分炎性细胞因子和趋化因子在感染后都有一定程度的升高，其中单核/巨噬细胞最重要的趋化因子CCL2在小鼠血清和支气管肺泡灌洗液中都明显升高，且维持在较高水平。考虑到CCL2的作用及其表达水平，提示CCL2可能在H7N9感染导致的急性肺损伤中起到关键的作用。
　　我们进一步检测了H7N9感染后小鼠血清和支气管肺泡灌洗液中CCL2的动态变化，结果显示小鼠感染H7N9后，CCL2从第1天开始便出现明显的上升，其中在支气管肺泡灌洗液中，CCL2的表达于第7天达峰，第9天开始回落；而在血清中一直呈高表达水平。通过共聚焦实验，我们也发现H7N9感染的小鼠肺组织中有大量的CCL2表达，进一步提示了CCL2具有重要的作用。
　　最后，为了明确CCL2在H7N9感染介导的急性肺损伤中的作用，我们通过CCL2基因敲除小鼠感染H7N9发现，CCL2基因敲除后，小鼠的死亡率明显降低，体重下降减缓，且小鼠肺水肿情况明显改善，肺损伤得到缓解。同时，我们发现CCL2基因敲除后，支气管肺泡中的中性粒细胞募集显著增加，相反的，单核/巨噬细胞的募集却被抑制了。病毒复制实验显示CCL2基因敲除后不能影响H7N9在小鼠体内的复制。
　　综上所述，我们首次建立了H7N9感染小鼠致死模型，分析获得了小鼠血清和支气管肺泡灌洗液中细胞因子及趋化因子表达谱，明确了CCL2表达的动态变化，且发现CCL2基因敲除后可有效缓解H7N9感染导致的急性肺损伤。我们在进一步实验中发现CCL2基因敲除后可抑制支气管肺泡中单核/巨噬细胞的募集，增强中性粒细胞募集。这些结果提示我们中性粒细胞在H7N9感染介导的急性肺损伤过程中可能起到关键作用，启发了我们的下一部分工作，同时也为趋化因子在H7N9禽流感病毒感染导致急性肺损伤过程中的研究提供了依据。
　　二、长链非编码RNA AVAN在天然免疫抗流感病毒中的作用机制研究
　　为了研究lncRNA在天然免疫抗流感病毒中的作用，我们首先利用二代测序检测了流感病毒感染患者危急重期与其恢复期的外周血中性粒细胞中lncRNA表达谱，发现了全新的差异表达的lncRNA共有433条；经过筛选进一步确定了一条全新的lncRNA在病毒感染后显著高表达，我们将其命名为AVAN(anti-virusand activate neutrophils，AVAN)。我们又利用NB和RACE实验，发现AVAN只有一个转录本，长度为517核苷酸，通过核质分离和RNA-FISH实验发现AVAN均匀分布在细胞质和细胞核内。通过检测 AVAN在病毒感染后的表达，发现其表达具有一定的剂量依赖和时间依赖。
　　在此基础上，我们又开展了AVAN功能研究。首先分析了测序结果中和AVAN表达相关的mRNA，发现这些mRNA主要和流感病毒复制以及天然免疫激活相关。功能获得和缺失实验表明AVAN能够促进I型干扰素的表达，抑制流感病毒复制；同时，我们也发现 AVAN能够有效地激活中性粒细胞，增强中性粒细胞的趋化性。
　　为了探究AVAN发挥抗病毒和增强中性粒细胞活性的具体分子机制，我们首先利用RNA pull down技术，对差异富集的蛋白进行质谱分析发现AVAN相对于其反义对照序列能够有效地富集E3泛素连接酶TRIM25；用免疫印迹和RIP实验进一步验证AVAN和TRIM25确有直接相互作用。同时，利用IP等实验，发现AVAN可增强TRIM25与RIG-I相互作用，促进RIG-I的泛素化，从而激活了RIG-I信号通路，诱导I型干扰素的表达，抑制流感病毒复制。
　　考虑到AVAN同TRIM25相互作用发生在细胞质，而AVAN在细胞核内也有大量分布。根据lncRNA的作用方式，我们推测AVAN可能会通过调节染色质修饰，进而影响其他基因的表达发挥功能。基因组定位分析可见，AVAN位于6号染色体，在转录因子FOXO3a启动子区的反义链上。我们构建了FOXO3a启动子区的双萤光素酶报告载体，发现AVAN能够增强其萤光素酶活性，我们进一步在转录水平和蛋白水平都验证了AVAN能够明显地促进FOXO3a的表达。为了明确AVAN是否能够与FOXO3a的启动子区直接结合，我们利用ChIRP实验，发现AVAN能够直接结合到FOXO3a启动子区（-600到-1000nt区域）。利用ChIP实验，我们发现AVAN能够影响FOXO3a启动子区（-600到-1000nt区域）H3K4me3和H3K27ac两种组蛋白修饰，以及该区域RNA聚合酶II的结合。以上实验结果表明AVAN能够通过反式作用方式来促进FOXO3a的表达。
　　为了进一步全面地了解AVAN对病毒感染后转录组的变化，我们用流感病毒感染AVAN过表达的细胞，利用mRNA芯片检测发现AVAN上调表达的基因主要富集在I型干扰素通路以及细胞因子分泌通路。这进一步证实了我们前面所发现的AVAN能够促进I型干扰素的表达和中性粒细胞活化的结果。
　　最后，我们利用腺相关病毒（adeno-associated virus，AAV）载体在C57BL/6小鼠体内过表达AVAN，然后利用流感病毒感染小鼠，分别从体重变化、死亡率、肺脏的病理改变、水肿程度以及病毒滴度等方面观察AVAN在小鼠体内的作用。我们发现AVAN过表达后，流感病毒介导的小鼠急性肺损伤的程度明显得到了缓解，而且肺脏中病毒滴度也有明显的下降。这证明在流感病毒感染时，AVAN能够有效地保护小鼠。
　　综上所述，我们首次获得了流感病人外周血中性粒细胞lncRNA表达谱；筛选获得了一条全新的lncRNA AVAN，并对其做了全面的注释和认识。通过功能实验发现AVAN能够促进I型干扰素的表达而抑制流感病毒复制，同时AVAN还能够促进中性粒细胞激活，增强其趋化性。在分子机制上，AVAN能够在细胞质中通过与TRIM25相互作用，影响RIG-I信号通路的激活；在细胞核中，AVAN能够通过反式作用方式促进FOXO3a的表达，增强中性粒细胞的活性。在体内实验中，我们证实AVAN能够有效缓解流感病毒介导的急性肺损伤。此研究为将来筛选新型抗流感病毒RNA药物提供了依据。
　　总之，通过以上两部分实验，研究了天然免疫反应在甲型流感病毒介导的急性肺损伤中的作用，探索了lncRNA在调节天然免疫抗流感病毒反应的作用及机制，建立了一整套天然免疫抗病毒研究体系，为今后进一步研究其他呼吸道病毒及新发突发传染病奠定了基础。我们发现趋化因子CCL2是甲型H7N9禽流感病毒感染导致急性肺损伤的重要因素，同时也鉴定出一条全新的lncRNA AVAN在调节天然免疫抗流感病毒反应中发挥着重要的作用，为将来筛选新型抗病毒药物提供了理论依据。

目录

声明

缩略词表

前言

第一部分趋化因子CCL2在甲型H7N9禽流感病毒感染导致急性肺损伤中的作用

1. 实验材料及试剂配置

1.1毒株

1.2 实验动物

1.3 细胞系

1.4 细胞培养试剂

1.5 抗体

1.6临床标本

1.8 其他试剂和耗材

1.9 主要仪器和设备

2.2 小鼠肺组织湿干比

2.3 小鼠肺脏病毒滴度检测

2.4 小鼠器官病理检测及肺组织中浸润的炎性细胞计数

2.5 小鼠血清和支气管肺泡灌洗液收集

2.6细胞因子检测

2.7小鼠肺脏免疫荧光实验

2.8小鼠支气管肺泡灌洗液中细胞计数

2.9统计学分析

3. 结果

3.1 甲型H7N9禽流感Hb01毒株能够感染小鼠并致急性肺损伤

3.2 H7N9感染导致小鼠死亡主要在天然免疫阶段

3.3 H7N9感染后小鼠血清中细胞因子、趋化因子表达谱

3.4 H7N9感染后小鼠支气管肺泡灌洗液中细胞因子、趋化因子表达谱

3.5 H7N9患者血清中CCL2呈现明显高表达

3.6 H7N9感染后小鼠血清和支气管肺泡灌洗液中CCL2表达动态变化

3.7 H7N9感染后小鼠肺组织中有大量的CCL2表达

3.8 H7N9感染后CCL2缺陷小鼠体重降低程度和死亡率都显著低于野生型小鼠

3.9 H7N9感染后CCL2-/-小鼠较野生型小鼠急性肺损伤有明显的缓解

3.10 CCL2-/-小鼠和野生型小鼠感染Hb01株H7N9禽流感病毒后其他脏器未见明显病理变化

3.11 CCL2-/-小鼠感染H7N9后肺部病毒滴度与野生型小鼠无明显差异

3.12 CCL2-/-小鼠和野生型小鼠感染Hb01株H7N9禽流感病毒后支气管肺泡中可见中性粒细胞明显募集

讨论

小结

第二部分长链非编码RNA AVAN在天然免疫抗流感病毒中的作用机制研究

1. 实验材料及试剂配制

1.1毒株

1.2 实验动物

1.3 细胞系

1.4 细胞培养试剂

1.5 抗体

1.6 临床标本

1.11 其他试剂和耗材

1.12 主要仪器和设备

1.13 主要试剂配制

2.1 人外周血中性粒细胞和单核细胞分离

2.2 细胞感染模型及样品收集

2.3 表达载体构建

2.4 细胞转染实验

2.5 RNA提取及反转录PCR实验

2.6 核质分离实验

2.7 5’和3’RACE实验

2.8 NB实验

2.9 RNA-FISH实验

2.10 ELISA测定细胞因子浓度

2.11 萤光素酶报告基因实验

2.12 病毒滴度测定

2.13 中性粒细胞趋化实验

2. 14 RNA-pull down实验

2.15 RIP实验

2.16 ChIRP实验

2.17 IP实验

2.18 Western Blot检测蛋白实验

2.19 ChIP实验

2.20 基因表达谱芯片实验

2.21 小鼠感染实验

2.22 统计学分析

3. 结果

3.2 流感病人外周血中性粒细胞中lncRNA表达谱

3.3人外周血中性粒细胞感染流感病毒体外模型建立

3.4 26条候选lncRNA在人外周血中性粒细胞中验证

3.5 26条候选lncRNA在人外周血单核/巨噬细胞中验证

3.6 26条候选lncRNA在A549细胞中验证

3.7 AVAN在测序标本和其他流感病人标本中显著高表达

3.8 AVAN在多种RNA病毒刺激后都显著高表达

3.9 AVAN在病毒感染中的表达模式

3.10 AVAN不具有编码蛋白能力

3.11 AVAN分布于细胞质和细胞核内

3.12 AVAN平均分布于细胞质和细胞核内

3.13 测序中与AVAN表达的mRNA基因富集分析

3.13 AVAN能够抑制流感病毒复制

3.14 AVAN能够促进I型干扰素表达

3.15 AVAN能够与TRIM25直接结合

3.16 AVAN能够促进TRIM25与RIG-I相互结合

3.17 AVAN能够促进RIG-I泛素化

3.18 AVAN能够激活RIG-I信号通路

3.19 AVAN通过TRIM25影响I型干扰素的表达

3.20 AVAN与FOXO3a在基因组上的位置关系

3.21 AVAN能够促进FOXO3a表达

3.22 AVAN能够直接结合到FOXO3a启动子区

3.23 AVAN能够影响FOXO3a启动子区RNA聚合酶II的结合

3.24 AVAN能够影响FOXO3a启动子区组蛋白修饰

3.25 AVAN与中性粒细胞活性相关

3.26 AVAN能够增强流感病毒介导的中性粒细胞激活

3.27 AVAN能够增强中性粒细胞的趋化性

3.28 mRNA芯片显示AVAN在流感病毒感染是主要参与抗病毒和细胞因子分泌调节过程

3.29 AVAN能够激活RIG-I信号通路

3.30 AVAN过表达能够能够减轻BJ501株流感病毒感染引起小鼠的体重降低程度并降低其死亡率

3.31 AVAN过表达能够能够减轻BJ501株流感病毒感染介导的小鼠急性肺损伤

3.32 AVAN过表达能够能够抑制BJ501株流感病毒在小鼠体内复制

讨论

小结

总结

参考文献

代表性学术论文

个人简历

致谢