Sigma-1受体对N型钙通道的负性调节作用及其机制研究

摘要

Sigma受体是具有伴侣蛋白活性的一类受体蛋白。鉴于其与其他哺乳动物蛋白没有同源性以及与其他受体相比所具有的独特的生理功能，现在也被认为是一类孤儿受体。目前认为Sigma受体家族包括两个亚型，一个亚型为Sigma-1受体，另一个亚型为Sigma-2受体。由于到现在为止，还未获得Sigma-2受体的克隆，也不清楚其氨基酸序列和结构，所以对它的研究比较少也比较滞后，研究重点一般集中在Sigma-1受体。Sigma-1受体主要聚集于细胞内质网，并广泛分布在MAM膜、细胞膜以及核膜等细胞膜系统上。经过研究人员对该受体将近40年的研究，尤其在获得Sigma-1受体的克隆及Sigma-1受体敲除鼠后，我们对其在结构和功能上的认识越来越清晰。Sigma-1受体是包含223个氨基酸的一条蛋白质单链，其分子量大小约为26 kDa。之前大多数研究认为Sigma-1受体包括两个跨膜结构域，且N端和C端均位于膜内侧。而在2016年，对人源Sigma-1受体的晶体结构解析结果表明，Sigma-1受体是以寡聚体(一般是三聚体)形式存在的一类单次跨膜蛋白，其 N端在膜外，C端则位于膜内侧。在其功能方面，Sigma-1受体在体内发挥着众多的生理功能，参与许多疾病的调控，如记忆损伤、癌症、心脏疾病、中风、抑郁、阿尔兹海默症、精神分裂等疾病。Sigma-1受体在中枢神经系统的表达最丰富，其功能也最为复杂。通过电生理学及行为药理学研究表明该受体参与包括抑郁、焦虑、精神分裂、学习记忆、成瘾以及疼痛在内的中枢疾病的发生发展过程。对以上疾病或病理过程进行成因分析，发现这些疾病的形成和发展均与相应的神经递质的释放和传导紧密相关。通过文献调研发现，Sigma-1受体对多巴胺能、谷氨酸能、5-羟色胺能、肾上腺素能、γ-氨基丁酸能和胆碱能神经递质的释放和传导都可产生或增强或抑制的调节作用，但是产生该调节作用的分子机制目前并未被完全阐明。根据文献调研结果，N型钙离子通道的开放可引起神经递质的释放并可直接调控神经递质的传递和突触的输出，在控制中枢内大部分神经递质释放和传导的过程中均有重要作用。根据目前的研究进展，我们得知Sigma-1受体可以与许多电压依赖或配体依赖的离子通道(包括钾离子通道、钠离子通道和酸敏感型离子通道等)发生相互作用，通过影响离子通道的电生理特性进而产生相应的生理效应。所以，我们推测Sigma-1受体是否通过调节 N型钙通道进而影响神经递质的释放和传导。但是，通过查阅文献，我们发现关于Sigma-1受体与N型钙通道之间的关系，目前还没有文献报道。即，目前为止我们还并不清楚Sigma-1受体能否通过影响N型钙通道的开放或关闭而影响神经递质的释放。
　　为探索Sigma-1受体对神经递质的释放的影响，我们选择 N型钙通道作为我们研究的切入点,故本实验旨在探讨Sigma-1受体对N型钙通道的调节作用。结合大胆碱能神经元(ChIs)是唯一可以合成并释放乙酰胆碱的神经元，本研究首次利用scRT-PCR以及免疫荧光的方法证明了Sigma-1受体在ChIs上有表达，并通过scRT-PCR实验证实了ChIs上主要表达N型钙离子通道，表明ChIs可以作为我们理想的研究模型。利用脑片膜片钳方法发现Sigma-1受体对ChIs上的钙通道存在抑制作用。为了进一步研究Sigma-1受体单独对 N型钙通道的作用，选用对研究离子通道具有明显优势的爪蟾卵母细胞作为研究对象，发现Sigma-1受体可以同时以配体依赖以及配体非依赖的方式对N型钙通道产生抑制作用。运用荧光共振能量转移(FRET)实验和免疫共沉淀(CO-IP)实验得知，Sigma-1受体与N型钙通道之间存在直接相互作用，在 HEK-293T细胞中可以形成蛋白复合体。
　　综上，本文利用脑片膜片钳方法、双电极电压钳技术以及分子生物学研究方法，阐明了 Sigma-1受体对N型钙通道的作用以及作用方式，并为进一步研究Sigma-1受体、N型钙通道以及神经递质三者之间的关系提供了相应的研究基础和线索。具体结果如下：
　　1、根据已有文献，纹状体的大胆碱能神经元(Cholinergic Interneurons,ChIs)上主要表达三种类型的钙离子通道，即：N型钙离子通道、P/Q型钙离子通道和L型钙离子通道。其中N型钙离子通道的表达丰度最高。为了验证这一结论，我们采用单细胞 RT-PCR技术(single cell Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,scRT-PCR)方法在38个ChIs上进行实验，结果表明在转录水平，92.1％的神经元上有N型钙通道的转录，78.9%的神经元上有P/Q型钙通道的转录，28.9%的神经元上有L型钙通道的转录。该实验结果与文献报道一致，提示我们可以选用ChIs作为我们的研究对象。
　　2、结合ChIs在调控乙酰胆碱的释放中的作用，我们选择ChIs作为研究对象。首先需要验证Sigma-1受体在ChIs上是否有表达。通过在30个ChIs上进行scRT-PCR,Sigma-1受体在ChIs上均有转录。进一步通过连续切片免疫荧光实验，发现在蛋白水平上Sigma-1受体在ChIs上也有表达。通过scRT-PCR以及免疫荧光的方法，我们首次证明Sigma-1受体在ChIs上有表达，这也成为我们研究Sigma-1受体在ChIs上对N型钙通道作用的基础。
　　3、运用电生理方法，在脑片背侧纹状体的ChIs上，我们记录到钙离子电流。向记录液中加入500 nM的N型钙通道特异性阻断剂ω--芋螺毒素-GVIA，钙离子电流被抑制到原电流幅度的27.7%±16.0%，表明N型钙电流在所记录的钙电流中占比达72.3%(n=3, P<0.05）。为观察Sigma-1受体是否对N型钙通道有调节作用。我们选用 Sigma-1受体的选择性激动剂 SKF-10047，将不同浓度的该激动剂加入到正常记录外液中，得到其对钙电流相应的抑制作用。50μM的SKF-10047抑制钙电流至原电流的61.3%±7.1%(n=11,P<0.05)，25μM和12.5μM的SKF-10047分别抑制钙电流幅度为原电流的71.6%±4.9%(n=9,P<0.05)和106.9%±18.2%(n=4,P>0.05)。此外，为进一步验证Sigma-1受体激动剂的抑制作用，我们选用另外一种激动剂Pre-084,50μM Pre-084可以抑制ChIs的钙电流至原电流幅度的72.9%±6.4%(n=7, P<0.05)。由此可知，Sigma-1受体激动剂对ChIs上的钙电流有抑制作用。为证实该抑制作用是通过Sigma-1受体介导的，我们给以Sigma-1受体拮抗剂BD-1063100μM,与50μM SKF-10047联合使用加入至记录液后发现，钙电流幅度为原电流的90.0%±5.1%（n=5,P>0.05）。结果表明，Sigma-1受体激动剂对ChIs钙电流的抑制作用是通过Sigma-1受体介导的，而这些钙电流中包括N-型钙电流。
　　4、鉴于爪蟾卵母细胞在研究离子通道上的优势，为方便进一步研究 Sigma-1受体对N型钙通道的作用，我们选用爪蟾卵母细胞为研究模型。将该受体和离子通道的cRNA首先分别注入卵母细胞作为对照组。通过双电极电压钳记录得到N型钙电流，并运用Western Blot得到Sigma-1受体的蛋白表达，以上结果可以说明独立表达Sigma-1受体和N型钙通道的卵母细胞表达模型建立成功。
　　5、为研究二者之间的相互作用，需建立同时表达Sigma-1受体和N型钙通道的表达体系。将两者的cRNA以体积比1:1混合均匀后注入卵母细胞，48 h后开始记录，结果显示，未能记录到正常的N型钙电流。通过逐渐降低Sigma-1受体的体积比，保持N型钙通道的体积不变，在Sigma-1受体与N型钙通道的体积比为0.5:1、0.25:1、0.125:1、0.0625:1、0.03125:1比例条件下，记录到的N型钙电流幅度分别为单独表达的N型钙通道的电流幅度的29.9%±3.9%(n=18,P<0.001),52.6%±3.8%(n=17,P<0.001),72.1%±3.7%(n=26,P<0.001),85.0%±5.8%(n=17,P<0.05),89.9%±7.5%(n=10,P>0.05)。由此得出结论，N型钙电流的幅度随着Sigma-1受体表达的减少而增大，并且这种作用是配体非依赖性的。
　　6、为了观察Sigma-1受体对N型钙通道在同时表达二者的卵母细胞中是否存在配体依赖型作用，我们选择体积比为Sigma-1受体: N型钙通道=0.25:1的卵母细胞作为研究对象。在此条件下，既有Sigma-1受体的表达，也可同时记录到N型钙电流。通过电生理方法，分别给以卵母细胞1μM、5μM、25μM、50μM、100μM的SKF-10047，得到其钙电流分别被抑制至原电流的94.9%±1.6%(n=8,P<0.05),89.9%±1.1%(n=20,P<0.005),83.0%±0.7%(n=10,P<0.001),73.5%±6.5%(n=7,P<0.001),67.7%±3.7%(n=5,P<0.001)。发现SKF-10047在该条件下均对N型钙通道有抑制作用。为验证该抑制作用是由Sigma-1受体介导的，向其记录液中加入Sigma-1受体拮抗剂50μM BD-1063,其对N型钙通道则无明显抑制作用（抑制至原电流幅度的93.2%±2.1%, n=6,P>0.05）。同时将50μM SKF-10047与50μM BD-1063加入记录液中，发现BD-1063可以阻断SKF-10047对N型钙通道的抑制作用（此时记录到的电流为原电流的87.2%±2.2%, n=6,P>0.05）。由此可知，SKF-10047对N型钙通道的抑制作用是由Sigma-1受体介导的。该结果与在ChIs上得到的结果是一致的。
　　7、为研究胞内钙释放通道对N型钙电流是否有影响，向电极内液中加入胞内钙释放通道的特异性阻断剂进行胞内给药。将胞内钙螯合剂20 mM BAPTA、IP3受体特异阻断剂100μM2-APB、Ryanodine受体特异性阻断剂10μM钌红分别加入电极内液，首先记录N型钙电流作为组内对照组，然后向记录液中加入100μM SKF-10047，统计细胞在受到Sigma-1受体激动剂刺激之前与之后的N型钙电流的差异。结果显示：100μM SKF-10047在BAPTA、钌红和2-APB存在时对N型钙电流的抑制作用分别为抑制至原电流的：83.4%±2.3%(n=6,P<0.05)、86.9%±1.1%(n=7,P<0.05)、93.9%±1.1%(n=5,P<0.05)，单独100μM SKF-10047的作用为67.7%±3.7%(n=5,P<0.05)。
　　8、由以上结果，我们提出假设：Sigma-1受体与N型钙通道在细胞内可能存在直接的蛋白相互作用或是二者之间的距离非常接近。为便于直观地观察到质粒的表达，我们选用HEK-293T细胞作为表达体系。利用荧光共聚焦显微镜，观察到Sigma-1受体(红色)与N型钙通道(绿色)均可正常表达。在同时转染两种蛋白的细胞内，黄色荧光结果显示Sigma-1受体与N型钙通道可同时正常表达，并可能存在共定位。
　　9、为确证Sigma-1受体与N型钙通道之间是否存在共定位，我们采用荧光共振能量转移实验(Fluorescence resonance energy transfer,FRET)初步验证这一猜想。符合荧光面积大于0.02m2，荧光强度大于或等于0.5条件的信号点可以认为存在蛋白-蛋白相互作用。实验结果显示，在共同转染Sigma-1受体与N型钙通道的细胞内，11个观察视野下，共有203个符合条件的信号点。而在阴性对照组中，没有发现符合条件的信号。初步得出结论：Sigma-1受体与N型钙通道在HEK-293T细胞中可以形成蛋白-蛋白直接相互作用。
　　10、利用免疫共沉淀实验进一步验证受体-离子通道蛋白复合体的存在。结果显示，Sigma-1受体的抗体或N型钙通道的抗体可以将Sigma-1受体与N型钙通道一并通过免疫作用沉淀下来。在阴性对照实验组中，未能观察到相应的或特异性的免疫印迹条带。这表明二者之间确实存在蛋白质之间的相互作用。通过以上实验结果，我们可知本研究首次在大鼠背侧纹状体的ChIs中发现
　　Sigma-1受体的表达。并且利用电生理学技术在大鼠脑片组织中的ChIs以及外源爪蟾卵母细胞中发现，Sigma-1受体可以配体依赖性地抑制N型钙电流。在爪蟾卵母细胞中，外源性表达的Sigma-1受体可以同时以配体非依赖性的方式抑制N型钙电流，并且该抑制作用与Sigma-1受体的蛋白表达量呈正相关的趋势。分子生物学实验表明外源性的Sigma-1受体与N型钙通道可以在HEK-293T细胞中形成蛋白复合体。由此可知，Sigma-1受体对N型钙通道的负性调节作用可能是通过蛋白-蛋白相互作用以及激动剂诱导的受体变构调节作用引起的。据此，我们推测Sigma-1受体可以通过调节N型钙通道的开放或关闭进而调控神经递质的释放。以上实验结果及结论填补了关于Sigma-1受体对N型钙通道的影响上的空白，为我们继续在组织水平或整体水平研究Sigma-1受体与N型钙通道之间的关系提供了线索，也为我们研究N型钙通道相关疾病的治疗提供了一个新的视角。

目录

声明

缩略词表

前言

第1章 Sigma-1受体在ChIs上对钙离子通道的调节作用

1实验材料

2实验方法

3实验结果

4讨论

5小结

第2章 Sigma-1受体对爪蟾卵母细胞上N型钙通道的调节作用

1实验材料

2实验方法

3实验结果

4讨论

5小结

第3章 Sigma-1受体对N型钙通道调节机制的初步探讨

1实验材料

2实验方法

3实验结果

4讨论

5 小结

结论

参考文献

附录

论著

个人简历

致谢