阿霉素诱导长链非编码RNA SNHG1细胞核驻留削弱hnRNPC同p53相互作用

摘要

长链非编码RNA（lncRNA）是一类长度大于200个核苷酸的RNA，它们没有编码蛋白质的能力，具有多样性的基因表达调控功能，可以在表观遗传修饰、转录及转录后等不同层次对基因表达进行调控。lncRNA具有多样的核质分布，根据其核质分布的不同其调控功能也具备多种作用模式，包括介导调控蛋白质分子到调控位点的顺式调控模式和反式调控模式、通过影响调控蛋白质分子活性改变靶基因的修饰水平和表达水平的调控模式，以及作为诱饵阻止其结合的调控蛋白质分子同靶点结合的模式等。因此，基于lncRNA不同的核质分布模式去探索其调控模式具有重要意义。同时，lncRNA的核质分布在特定应激条件下（如DNA损伤等）是否会发生改变？这种改变是否具有生物学意义？是否依赖于lncRNA同特定蛋白的结合？对这些科学问题的深入研究将有助于揭示未知lncRNA的功能以及新的调控机制。
　　作为重要的转录因子，p53蛋白可以通过与启动子区域特定DNA序列结合进而调控靶基因转录。大量研究表明，p53基因是重要的抑癌基因，在DNA损伤修复、细胞周期阻滞和细胞凋亡等方面发挥重要作用。当面对各种应激信号时，p53蛋白也受到多种调控机制的调控。这其中既有蛋白分子调控p53的表达和稳定性，也有RNA分子参与其中。近年来的实验证明多种lncRNA，如LincRNA-p21、PANDA、MALAT1等，也参与到了p53的调控网络中，并影响其下游基因的表达。那么是否有新的lncRNA参与到p53蛋白调控网络中？是否lncRNA可以介导p53蛋白同其他蛋白之间的直接相互作用？这些科学问题同样需要进一步研究。
　　核不均一核糖核蛋白（hnRNP）是一类重要的 RNA结合蛋白，在细胞内可以同多种蛋白质及RNA分子相互作用，调控mRNA前体的可变剪接，在mRNA转运、mRNA稳定性调节及mRNA的识别分类等方面具有重要的生物学功能。一些hnRNP参与到了p53蛋白功能调控中，如hnRNPK可以调节p53的转录活性，当DNA损伤发生时hnRNPK与p53协同调节靶基因的转录。同时，亦有研究表明lncRNA可以通过结合与p53的相互作用的hnRNP进而调控p53本身的功能，如lncRNA Apela削弱hnRNPL蛋白与p53蛋白的结合能力，增加p53蛋白水平及p53蛋白的线粒体分布等。实验室前期工作证明hnRNPC与p53蛋白直接相互作用，且可以调节p53蛋白的稳定性和转录活性，同时二者相互作用受到RNA的阻抑。基于此，寻找出削弱p53和hnRNPC直接相互作用的lncRNA，并对其功能展开研究，有助于揭示lncRNA在p53及其相互作用蛋白的调控网络中的作用。
　　hnRNPC是重要的RNA结合蛋白，它在细胞中的含量非常高，且主要分布在细胞核内，这要求潜在的lncRNA除了能够和hnRNPC结合也需要在细胞内要有较高的表达水平，同时在特定条件下在细胞核内具有分布。因而首先采用生物信息学分析结合实验验证筛选出削弱hnRNPC同p53蛋白相互作用的lncRNA。通过将hnRNPC的CLIP数据库中与之结合lncRNA的水平和p53+/+ HCT116细胞中lncRNA的表达水平相结合，筛选到了SNHG1这条具有较高表达水平且可能同hnRNPC结合的lncRNA。通过阿霉素处理p53+/+HCT116细胞，发现SNHG1可以发生核驻留；通过hnRNPC的RNA免疫沉淀实验证明SNHG1可以同hnRNPC结合；通过SNHG1的RNA pulldown实验证明SNHG1657-667 bp的连续U区域是结合hnRNPC的关键区域；通过hnRNPC同p53蛋白的免疫沉淀实验及GST pulldown实验证明，SNHG1可以削弱hnRNPC同p53蛋白之间的直接相互作用，而缺失了hnRNPC结合能力的SNHG1Del则不影响hnRNPC同p53蛋白的结合。通过一系列 SNHG1的截短体与缺失体过表达实验结合阿霉素处理证明SNHG1的498-509 bp区域对阿霉素诱导的SNHG1核驻留至关重要，而该区域也是SNHG1与NCL蛋白的结合位点。通过干涉NCL并进行阿霉素诱导进一步证明SNHG1与NCL的结合对对阿霉素诱导的SNHG1核驻留至关重要。
　　为了研究SNHG1核驻留导致的生物学效应，通过在细胞核内过表达SNHG1模拟阿霉素条件下SNHG1核驻留情况。基于核内表达载体snoVector构建SNHG1及缺失hnRNPC结合位点的SNHG1Del的细胞核内表达载体，成功实现了核内过表达SNHG1；通过双荧光素酶报告基因实验证明在细胞核内表达SNHG1非SNHG1Del可以上调p53的转录活性；通过检测p53蛋白半衰期发现在细胞核内表达SNHG1而非SNHG1Del可以增强p53蛋白的稳定性进而上调p53蛋白水平；通过CCK8细胞增殖实验表明在细胞核内表达SNHG1而非SNHG1Del可以抑制细胞增殖；通过流式细胞术检测细胞凋亡发现在细胞核内表达SNHG1而非SNHG1Del促进p53依赖的细胞凋亡。
　　已有文献报道SNHG1在非小细胞肺癌和肝癌中具有促进细胞增殖的功能，这是否暗示了正常状态下，定位于细胞质的SNHG1也具有促进结肠癌发生发展的功能？通过检索肿瘤样本lncRNA表达数据库发现SNHG1在多种人肿瘤组织中的表达水平都高于癌旁组织，而在多个结肠癌样本的数据中SNHG1表达水平也高于癌旁样本。通过双荧光素酶报告基因实验发现，干涉SNHG1可以上调p53的转录活性；通过 p53蛋白的Western Blot检测发现，干涉SNHG1可以增加p53蛋白水平；通过流式细胞术检测细胞凋亡发现干涉SNHG1可以促进p53依赖的细胞凋亡。通过SNHG1的RNA pulldown结合质谱分析发现SNHG1可能和NCL、ILF3等蛋白结合，而它们是p53重要的结合蛋白及调控蛋白，这可能是SNHG1在结肠癌HCT116细胞中调控p53蛋白的分子机制的一个重要环节。因而可以推断在人结肠癌中SNHG1可能具有促进肿瘤发生发展的功能。
　　综上所述，本研究的创新点和结论如下：
　　1.首次证实了在阿霉素作用条件下长链非编码RNA SNHG1可以发生细胞核驻留，且这种核驻留依赖于SNHG1同NCL蛋白的结合。
　　2.首次证实SNHG1可以结合hnRNPC，并通过竞争结合hnRNPC削弱hnRNPC与p53蛋白的直接相互作用，发现了lncRNA调控蛋白质分子相互作用的新模式。
　　3.利用细胞核内表达载体在细胞核内过表达SNHG1，以模拟阿霉素诱导的SNHG1细胞核驻留，揭示了核驻留的SNHG1可以增加p53蛋白稳定性，提高p53蛋白水平、转录活性与磷酸化水平，促进p53依赖的细胞凋亡，抑制肿瘤细胞增殖。
　　4.揭示了在非DNA损伤状态下抑制SNHG1的表达能增加p53蛋白水平及转录活性。这说明细胞质中的SNHG1对p53的调控作用与细胞核中的SNHG1不同，进而提示了lncRNA的不同核质定位可能发挥不同的调控作用。

目录

声明

缩略语

前言

1 长链非编码RNA

2 p53蛋白

3 p53蛋白与RNA调控

4 核不均一核糖核蛋白（hnRNP）家族与核不均一核糖核蛋白C（hnRNPC）

第一章 hnRNPC结合lncRNA的筛选鉴定

1 材料与方法

2 结果与讨论

第二章 SNHG1削弱hnRNPC同p53蛋白相互作用

1 材料与方法

2 结果与讨论

第三章 阿霉素诱导SNHG1细胞核驻留依赖于SNHG1同NCL的相互作用

1 材料与方法

2 结果与讨论

第四章 阿霉素诱导SNHG1的细胞核驻留增加p53蛋白稳定性

1 材料与方法

2 结果与讨论

第五章 SNHG1在结肠癌HCT116细胞功能初探

1 材料与方法

2 结果与讨论

结论

展望与思考

参考文献

在学期间发表的与学位论文密切相关的代表性论著（全文）

个人简历

致谢