影响农杆菌介导大豆遗传转化效率因素的研究

摘要

大豆是世界上最重要的粮油作物之一，因此其再生体系的建立和遗传转化的研究一直受到学者们的广泛关注。大豆的遗传转化虽然取得了一定的成果，但是仍存在很多困难，大大限制大豆分子育种的效率与功能基因组的研究。因此，建立一种高效而稳定的大豆转基因技术体系是非常必要的。 为了建立高效大豆转基因技术体系，本文首先利用我国栽培种大豆品种，以成熟子叶节为外植体进行了大豆高频再生体系的建立研究；然后以萌发1d的半片种子为目标组织，在复合针针刺条件下对影响农杆菌介导大豆遗传转化效率的各种因素进行了分析。 大豆再生体系研究结果表明：不同基因型之间再生频率差异较大，在所试的9个品种中，合丰25不定芽诱导率最高，达到77.4％；培养基中大量元素和微量元素的不同配比也影响不定芽诱导率，在1/2 MS大量元素+1/2微量元素+B5有机成分的培养基上不定芽诱导率最高，达到77.1％；诱导培养基中激素的最佳浓度为1.5 mg/L6-BA+.0.3 mg/LTDZ；大豆种子的萌发7d时，不定芽诱导效率最高，为76％。 为了建立有效的潮霉素筛选体系，将农杆菌侵染的半片种子在共培养基上共培养3～5 d后，在无筛选剂的培养基上恢复培养3 d，然后放在含有不同浓度潮霉素的筛选培养基上进行筛选。实验结果表明，最适潮霉素筛选浓度为8 mg/L。 利用GUS基囱的瞬时表达效率对影响农杆菌介导遗传转化效率的因素进行了研究：基因型对转化效率有影响，在所试的6个品种中，合丰25的转化效率最高，平均每个外植体出现7.3个蓝色斑点；采用复合针刺伤的方法可以明显提高转化效率，刺伤2次效查最佳,平均每个外植体上出现的蓝色斑点数超过8.0；农杆菌菌液浓度对转化效率也有影响，随着菌液浓度的增大，转化效率有提高的趋势，在OD<,600>=0.7时，转化效果最高，平均每个外植体上的蓝色斑点数达到8.2；共培养基中添加200umol/L乙酰丁香酮时，在所试的4个品种(合丰25，合丰35，合丰39，东农42)中转化效率均达到最高；侵染时间以30 min最佳；共培养时间为5 d时转化效率最高；抗氧化剂可以明显提高转化效率，在共培养基中添加1.0 mmol/L DTT和1.0 mmol/L Na<,2>S<,2>O<,3>时，比未加抗氧化剂的对照转化效率提高了近一倍；L-半胱氨酸浓度对转化效率无显著影响。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩写词及英汉对照

声明

文献综述

1综述前言

1.1大豆再生体系的研究进展

1.2大豆转基因的方法

1.3大豆转基因的应用

1.4大豆转基因研究展望

1.5研究的目的和主要内容

1大豆子叶节高频再生体系的建立

1.1材料与方法

1.1.1大豆品种

1.1.2试剂

1.1.3试验方法

1.2结果与分析

1.2.1基因型对不定芽诱导的影响

1.2.2大量元素和微量元素的不同配比对不定芽诱导的影响

1.2.3 6-BA和TDZ对不定芽诱导的影响

1.2.4萌发天数对不定芽诱导的影响

2影响农杆菌介的大豆遗传转化因素的研究

2.1材料与方法

2.1.1供试大豆品种

2.1.2菌株和载体

2.1.3培养基

2.1.4实验方法

2.2结果与分析

2.2.1潮霉素筛选浓度的确定

2.2.2基因型对转化效率的影响

2.2.3不同生长时期的农杆菌对转化效率的影响

2.2.4伤处理方式对转化效率的影响

2.2.5乙酰丁香酮浓度对转化效率的影响

2.2.6共培养天数对转化效率的影响

2.2.7侵染时间对转化效率的影响

2.2.8半胱氨酸对转化效率的影响

2.2.9抗氧化剂对转化效率的促进作用

2.3讨论

2.3.1大豆子叶节高效再生体系的建立

2.3.2影响农杆菌介导的大豆遗传转化因素的研究

结论

参考文献

图版

附录 培养基的主要成分及浓度

致谢