低能N+注入介导秦艽基因组DNA转化酵母的研究

摘要

龙胆苦苷(Gentiopicroside)为裂环环烯醚萜苷类化合物，大量存在于药用植物秦艽(Gentianamacrophylla,G.macrophylla)中，是评价龙胆属药材的主要指标，具有抗氧化、抗炎、保肝、利胆及抗肿瘤等作用。近年来，临床用药量的增加、多年的过渡采挖，造成了野生秦艽资源的严重匮乏。人工栽培存活率低，药材质量下降，受季节变化影响明显，龙胆苦苷产量低等问题导致龙胆苦苷的供应难以满足临床应用的需要。因此，迫切需要寻求及扩大龙胆苦苷新型药源途经来满足其日益增长的需求。随着低能离子注入生物工程学的发展，低能离子注入因其独特的反应机制及诱变效应，使其在微生物、植物育种及农作物改良方面具有广泛的应用前景。
　　 本论文首先以谷胱甘肽(Glutathione，GSH)产量为指标对多形汉逊酵母DL-1(HansenulapolymorphaDL-1，H.polymorphaDL-1)培养条件进行优化，建立了两阶段温度调控发酵法生产GSH。在此基础上，对N+注入H.polymorphaDL-1的条件进行了探索，确定了最佳的离子注入参数。最后，利用低能离子注入技术介导秦艽基因组DNA转化酵母，构建产龙胆苦苷的酵母工程菌，为解析龙胆苦苷生物合成基因提供实践材料，为后续探索遗传改造微生物生产倍半萜类物质提供理论和数据支持，对开展药用植物基因资源开发和保护具有重要意义。研究结果如下:
　　 (1)建立了一种提高谷胱甘肽产量的方法。通过单因素试验确定了H.polymorphaDL-1的最适生长温度、GSH合成的最佳温度和培养基初始pH，其分别为30℃、37℃和pH6.5;接着，通过变温调控分批发酵，确定了最佳变温条件为:45℃培养12h后将温度降低为37℃继续培养36h，采用该方法摇瓶发酵后GSH总量及GSH含量分别为416.13mg/L和103.15mg/g，比恒温培养(37℃)分别提高了69.6％和55.4％;最后，通过5L发酵罐扩大培养，生物量(DryCellWeight，DCW)和GSH产量分别达42.35g/L和927.68mg/L。表明变温调控方法可用于提高H.polymorphaDL-1发酵生产GSH的产量。
　　 (2)分别以注入后酵母细胞的存活率及产龙胆苦苷能力为依据，确定了N+注入转化H.polymorphaDL-1的最佳参数为:注入能量，25keV;剂量，2.5×1016ion/cm2，10-3真空条件下，脉冲注入10s，间隔10s。用上述条件处理后，H.polymorphaDL-1的正突变率为38％，通过ZnCl2抗性筛选获得了一株GSH突变菌株，摇瓶变温发酵后DCW达6.24g/L，相对于原始菌株提高了9.09％;GSH产量为337.16mg/L，比原始菌株提高1.56倍;继代培养八代GSH产量变化不显著。将该菌命名为Hansenulapolymorpha18(HP18)，已申请保藏于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期为:2012年9月29日;保藏号为:CGMCC.NO.6642。
　　 (3)建立了产龙胆苦苷酵母工程菌的快速筛选方法。首先采用颜色反应进行定性分析，然后采用TLC及RP-HPLC法进行定量检测，具体如下:
　　 a颜色反应酸水解反应(10％H2SO4)、Molish及Fehling试验;2％CuSO4、Weiggering反应及香草醛试验;20％NaOH和盐酸-镁粉反应。
　　 b高效液相色谱法测定龙胆苦苷含量的色谱条件:色谱柱为DiamonsilC18柱（250mm×4.6mm，5μm）;紫外检测器:Waters2487;流动相为甲醇:水(30∶70);在室温下测定，检测波长:270nm;进样量:20μl;流速:1.0nh/min。
　　 在该色谱条件下检测秦艽中龙胆苦苷含量，平均回收率为99.24％，RSD=1.16％，精密度试验RSD=2.2％，龙胆苦苷的保留时间tR=12.3min。
　　 (4)采用GD2611-01植物基因组DNA提取试剂盒提取秦艽基因组DNA，用紫外分光光度法及1％琼脂糖凝胶电泳测定DNA纯度为OD260/OD280=1.8±0.02，浓度约为1μg/μl，无蛋白质、RNA、多糖等杂质。
　　 (5)低能N+注入介导秦艽基因组DNA转化H.polymorphaDL-1，存活率低，通过颜色反应进行初筛，呈阳性的菌株30株，占随机挑选总数的3.98％;经摇瓶复筛及RP-HPLC法分析获得一株产龙胆苦苷的酵母工程菌，编号为DL10049。
　　 (6)酵母工程菌DL10049用无机培养基摇瓶发酵72h龙胆苦苷产量为2.588mg/L，生物量为2.4g/L;YPD培养基摇瓶发酵72h龙胆苦苷产量为2.208mg/L，生物量为4.6g/L。
　　 (7)将工程菌DL10049继代培养6代，RP-HPLC法测定发酵液中龙胆苦苷含量，每代菌龙胆苦苷产量均有小幅降低，第六代相比于第二代降低了30.9％，说明该菌株稳定性差。

目录

摘要

缩写表

1 绪论

1．1 药用植物秦艽的概况

1．1．1 生物学特征

1．1．2 秦艽的主要有效成分

1．1．3 秦艽中萜类化合物的合成途径及其应用研究

1．1．4 秦艽的药理学研究

1．2 龙胆苦苷的研究概述

1．2．1 龙胆苦苷的理化性质

1．2．2 龙胆苦苷的药理作用

1．2．3 龙胆苦苷的提取分离与检测

1．2．4 龙胆苦苷的生物合成途径

1．3 离子束生物工程技术的研究概况

1．3．1 低能离子注入技术原理

1．3．2 离子注入技术的特点

1．3．3 低能离子注入技术的应用

1．4 多形汉逊酵母的研究概况

1．4．1 多形汉逊酵母的培养特性

1．4．2 多形汉逊酵母的应用

1．5 谷胱甘肽的研究概况

1．6 本课题的目的与意义

1．6．1 本课题的目的

1．6．2 本课题的意义

1．7 本课题的前期研究进展

1．8 本课题研究内容

1．8．1 多形汉逊酵母培养条件的研究

1．8．2 N+注入多形汉逊酵母条件的考察

1．8．3 产龙胆苦苷工程菌的构建

1．9 本课题的基本原理及基本路线

1．9．1 本课题的基本原理

1．9．2 本课题采用的技术路线

1．9．3 本课题研究工作中面临的技术难点和拟采取的解决办法

2 多形汉逊酵母DL-1培养条件的研究

2．1 试验材料与仪器

2．2．1 实验材料

2．1．2 主要试剂与设备

2．2 试验方法

2．2．1 培养基及培养方法

2．2．2 分析方法

2．3 研究内容

2．3．1 DTNB法测定GSH

2．3．2 温度对多形汉逊酵母DL-1生长的影响

2．3．3 初始pH对多形汉逊酵母DL-1生长的影响

2．2．4 变温分批发酵生产GSH

2．2．5 高密度发酵生产GSH

2．4 结果与分析

2．4．1 DTNB法测定GSH

2．4．2 温度对GSH产量及菌体生长的影响

2．4．3 初始pH对GSH产量影响

2．4．4 多形汉逊酵母DL-1生长曲线的测定

2．4．5 变温调控分批发酵生产GSH

2．4．6 高密度发酵生产GSH

2．5 小结

3 N+注入多形汉逊酵母DL-1条件的考察

3．1 试验材料与仪器设备

3．1．1 实验材料

3．1．2 主要试剂与仪器设备

3．2 试验方法

3．2．1 多形汉逊酵母的N+注入方法

3．2．2 GSH高产菌株的选育

3．3 研究内容

3．3．1 ZnCl2抗性筛选物浓度的确定

3．3．2 N+注入能量及剂量的考察

3．3．3 正突变率的测定

3．3．4 GSH高产菌株的诱变选育

3．3．5 突变菌的遗传稳定性试验

3．4 结果与分析

3．4．1 抗性筛选物浓度的确定

3．4．2 不同能量与剂量注入后菌株的生长情况

3．4．3 氮离子注入多形汉逊酵母DL-1的诱变效果

3．4．4 谷胱甘肽高产菌株的筛选

3．4．5 突变菌的传代稳定性试验

3．5 小结

4 产龙胆苦苷酵母工程菌的构建

4．1 实验材料及仪器设备

4．1．1 实验材料

4．1．2 主要试剂与仪器设备

4．2 试验方法

4．2．1 秦艽有效成分的定性检识

4．2．2 龙胆苦苷的定性定量分析

4．2．3 秦艽基因组DNA的提取

4．2．4 酵母菌转化

4．2．5 产龙胆苦苷工程菌的筛选

4．3 研究内容

4．3．1 定性检识方法的研究

4．3．2 龙胆苦苷定量分析的方法学研究

4．3．3 秦艽基因组DNA提取

4．3．4 多形汉逊酵母DL-1的注入与转化

4．3．5 酵母菌平板培养与计数

4．3．6 产龙胆苦苷工程菌的筛选

4．4 结果与分析

4．4．1 秦艽有效成分的初步定性检识

4．4．2 TLC法定性检测样品溶液中龙胆苦苷

4．4．3 HPLC法定量分析龙胆苦苷

4．4．4 秦艽基因组DNA的提取及检测

4．4．5 重组酵母菌的平板培养与计数

4．4．6 产龙胆苦苷工程菌筛选

4．4．7 高效液相色谱法定量分析酵母工程菌发酵产物

4．4．8 重组菌株稳定性试验

4．5 小结

5 结论与展望

5．1 结论

5．2 展望

致谢

参考文献

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