犬瘟热病毒F蛋白单克隆抗体的制备、鉴定及抗原捕获ELISA方法的建立

摘要

本研究以纯化的犬瘟热病毒(CDV)F蛋白免疫BALB/c小鼠，运用淋巴细胞杂交瘤技术进行细胞融合，并用间接ELISA方法进行筛选，用IFA、Western-blot对各株抗CDVF蛋白单克隆抗体进行生物学特性鉴定。结果获得7株单克隆抗体具有对CDV的特异性，分别命名为:2D6，3E10，3A2，5B7，5F6，6H8，9B6;单抗亚类鉴定结果分别为IgG2a，IgG1，IgG2b，IgG1，IgG1，IgG2a和IgG1;各株腹水单克隆抗体的ELISA效价为1∶2000～1∶16000;经细胞中和试验初步证实2株单抗(5B7、9B6)具有中和犬瘟热病毒感染Vero细胞的作用，中和效价分别为1∶320和1∶640;各株单抗亲和力测定结果为:2D6＞6H8＞3E10＞5F6＞3A2＞9B6＞5B7;液相相加试验证实7株单抗的作用位点不同，其中2D6，5F6的作用位点非常相近。
　　 本研究采用饱和硫酸铵盐析和Sephadex G-200柱层析法从细胞培养物中纯化CDV，经紫外分光光度计测定，其浓度为1.292mg/mL。并以此为抗原免疫兔子，制备高免血清并提纯IgG。兔抗CDV高免血清琼扩效价为1∶32时收集血清，经饱和硫酸铵盐析和Sephadex G-50纯化，兔抗CDV IgG蛋白浓度为8.246mg/mL。
　　 选取2D6和制备的CDV IgG建立了检测CDV的抗原捕获ELISA方法并对其反应条件进行优化。兔抗CDV IgG、McAb、HRP-羊抗鼠最佳稀释度分别为1∶3200、1∶200、1∶800倍稀释。封闭液、抗体稀释液分别为1％BSA、0.1％BSA;该检测方法特异、可靠、方便、快捷，不需要特殊设备和技术，便于推广。

目录

摘要

英文缩写词表

前言

第一部分 文献综述

1 犬瘟热概述

2 诊断技术研究进展

第二部分 研究内容

1．材料

1．1 病毒、细胞、血清及实验动物

1．2 主要仪器与耗材

1．3 主要试剂

1．4 主要试剂的配制

2 方法

2．1 CDV抗原的制备

2．2 兔抗CDV多克隆抗体的制备

2．3 单克隆抗体的制备

2．4 McAbs特性鉴定

2．5 抗原捕获ELISA方法的建立

2．6 抗原捕获ELISA试验方法的鉴定

3 结果

3．1 CDV的增殖

3．2 CDV TCID50的测定

3．3 CDV浓度测定结果

3．4 兔抗CDV IgG纯度鉴定及蛋白含量测定

3．5 间接ELISA方法包被抗原与血清工作浓度的筛选

3．6 杂交瘤细胞株的建立

3．7 McAbs特性鉴定

3．8 抗原捕获ELISA方法的建立

3．9 抗原捕获ELISA方法的鉴定

4．讨论

4．1 免疫抗原

4．2 细胞融合及腹水单抗效价的测定

4．3 单抗的纯化

4．4 单抗亲和力

4．5 抗原表位初步分析

4．6 间接免疫荧光

4．7 MCAb的临床应用分析

4．8 建立抗原捕获ELISA诊断犬瘟热病毒方法的意义

4．9 抗原捕获ELISA诊断方法的建立

4．10 ELISA的操作

5 结论

参考文献

致谢

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