H5N1亚型高致病性禽流感病毒NS1基因的序列分析及原核表达

摘要

禽流感是由A型流感病毒引起的一种禽类烈性传染病，不仅给养禽业带来重大的经济损失，而且导致人类的感染和死亡。高致病性禽流感已被世界动物卫生组织(OIE)列为急烈性传染病。
　　 NS1蛋白可能在破坏被病毒感染宿主细胞的过程中扮演一个重要角色，对流感病毒的致病性起着非常重要的作用，可能与多个细胞内受体结合，破坏细胞内的关键信号传导通道，致使宿主细胞死亡。基于该背景，本研究从分子水平初步了解和分析了NS1基因的遗传变异规律及特点，进一步丰富了NS1基因功能研究方面的资料。
　　 由于我国大多数鸡场采用禽流感灭活疫苗免疫鸡群，在一定程度上控制了禽流感疫情的发生和流行，但也干扰了禽流感的正常诊断，增加了禽流感预防与控制的难度。研究表明，感染禽流感病毒的鸡体内产生禽流感病毒结构蛋白抗体和非结构蛋白抗体，而疫苗免疫鸡体内主要产生结构蛋白抗体，利用这种抗体差异，可用非结构蛋白区分免疫鸡群与野毒感染鸡群。因此，本研究通过对H5N1亚型禽流感病毒非结构蛋白(NS1)的表达，为建立一种可以区分疫苗免疫和野毒感染鸡群的快速鉴别诊断方法打下基础。
　　 根据Genbank上发表的H5N1亚型禽流感病毒NS1的基因序列，设计并合成一对特异性引物，利用RT-PCR技术扩增了8株安徽巢湖和休宁地区不同宿主来源的H5N1亚型禽流感病毒的NS1基因，构建重组克隆质粒后送测序并分析。
　　 从中选取A/Swine/Anhui/31205/2007(H5N1)株，将其NS1基因重组于高效表达载体pET-32a中，构建重组表达载体。经酶切及测序鉴定，成功构建了重组表达载体pET-NS1，并将其转化BL21(DE3)感受态细胞中，在37℃条件下，用终浓度1mmol/L的IPTG诱导表达5h，经15％的SDS-PAGE分析，NS1蛋白以融合蛋白的形式表达，其分子量大约为51KD，说明NS1基因已在大肠杆菌中得到表达。经Western-blot鉴定，表达的NS1融合蛋白与感染H5N1亚型禽流感病毒的阳性血清具有反应原性。

目录

摘要

英文缩写词表

文献综述

1 综述前言

2 禽流感病毒的概述

2．1 禽流感病毒的分类及命名

2．2 禽流感病毒形态结构及特性

3 禽流感病毒分子生物学的研究进展

3．1 禽流感病毒的基因组

3．2 禽流感病毒基因组编码蛋白的功能

3．3 禽流感病毒的复制

3．4 禽流感病毒的抗原变异

4 禽流感的流行现状及特点

4．1 H5N1亚型禽流感的国际流行情况

4．2 H5N1亚型禽流感在我国内地的流行情况

5 H5N1亚型禽流感病毒感染的宿主范围及传播模式

6 禽流感的诊断技术研究进展

7 禽流感的预防和控制

7．1 影响禽流感防控的主要因素

7．2 禽流感防治的重点

7．3 禽流感防治的具体措施

试验一 H5N1亚型禽流感病毒NS1基因分子流行病学分析

1 试验材料

1．1 菌种和载体

1．2 毒株和血清

1．3 SPF鸡胚

1．4 主要试剂

1．5 主要仪器

1．6 主要溶液配方

2．试验方法

2．1 引物的设计与合成

2．2 病毒的分离

2．3 病毒RNA的提取

2．4 cDNA的制备

2．5 PCR扩增

2．6 DNA琼脂糖凝胶电泳

2．7 PCR扩增产物的回收

2．8 目的片段与载体的连接

2．9 感受态细胞的制备

2．10 连接产物的转化

2．11 碱裂解法小量提取质粒

2．12 重组质粒的鉴定

3 结果与分析

3．1 RT-PCR扩增

3．2 重组克隆质粒构建及酶切鉴定

3．3 NS1基因序列测定与分析

4 讨论

4．1 NS1基因的扩增及克隆

4．2 NS1基因的序列分析

5 小结

试验二 H5N1亚型禽流感病毒NS1基因的原核表达

1 试验材料

1．1 菌种和载体

1．2 主要溶液配方

2 试验方法

2．1 阳性质粒和载体酶切回收

2．2 目的片段与载体的连接

2．3 BL21感受态的制备

2．4 连接产物的转化

2．5 重组质粒的鉴定

2．6 重组质粒的诱导表达

2．7 最佳诱导条件的确定

2．8 表达产物的检测

3 结果

3．1 重组表达载体质粒pET-NS1的筛选与鉴定

3．2 表达产物的SDS-PAGE电泳检测以及Western-blot分析

4 讨论

4．1 高效表达载体的选择

4．2 最佳诱导条件的优化

4．3 重组蛋白的抗原性鉴定

5 小结

结论

参考文献

致谢

攻读硕士期间发表的论文

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