水杨酸诱导黄瓜幼苗抗冷性的基因表达

摘要

水杨酸(Salicylicacid，SA)是植物体内的一种简单的酚类物质，作为内源信号分子，在植物许多生理过程中起着非常重要的作用。SA能提高植物对生物胁迫和非生物胁迫的抗性，如微生物胁迫、温度胁迫、渗透胁迫等。黄瓜（Cucumissativus）属于葫芦科甜瓜属一年生草本植物，起源于亚热带，是典型的冷敏型植物。黄瓜所有组织以及果实都是对低温敏感的，通常10～12℃即不能正常生长，低于5℃就会难以生存。通过对SA诱导的黄瓜冷胁迫相关基因的分离及其性质的研究，构建抗冷性转基因黄瓜品种，可解决园艺生产中黄瓜易受冷害的问题，同时可探讨植物抗冷的机理和SA诱导植物抗逆性的分子机理。本实验主要通过mRNA差异显示技术和反向Northern杂交筛选SA诱导的黄瓜冷胁迫相关基因，并对这些基因的性质进行初步探讨和研究。
　　 以黄瓜幼苗为试验材料，8±1℃冷胁迫下分别用SA(3mmol/L，pH6.0)溶液和蒸馏水喷施黄瓜（“新优30”）幼苗，以处理后48h的叶片总RNA为模板反转录cDNA，利用mRNA差异显示技术和反向Northern杂交筛选冷胁迫下SA诱导的黄瓜幼苗cDNA，主要研究结果如下:
　　 1、mRNA差异显示技术分离回收12个cDNA序列，经反向Norhtern杂交验证其中3个为SA显著诱导但不是SA依赖表达的cDNA片段，分别命名为SICCL_1，SICCL_2和SICCL_3，Genbank登陆号分别为FG120885，FG120886和FG120887。cDNA片段连接到pGM-T质粒载体，转化大肠杆菌DH5α菌株，经酶鉴定，测序。测序结果显示:SICCL_1，SICCL_2和SICCL_3长度为178bp，201bp和241bp，约100～500bp。
　　 2、Blastn同源性检索结果表明:SICCL_1与黄瓜花叶病毒(CucumberMosaicVirus，CMV)诱导的甜瓜叶片基因AM734282.2高度同源;SICCL_2与5个基因cDNA片段高度同源(EL890967.1，EH050706.1，CD715793.1，CB345776.1和BO157769.1)，它们分别来自五种胁迫对应的五种植物;未发现与SICCL_3同源的序列，可能为新的基因。由此推测，SA可能诱导植物基因表达产生交叉保护反应而对各种生物和非生物胁迫产生广谱抗性。我们将通过RACE或构建cDNA文库等方法获得这些基因全长cDNA，并对这些基因的功能作进一步研究。

目录

摘要

缩略词

前言

1 植物冷害与抗冷机理的研究进展

1．1 植物对冷害的反应

1．2 植物抗冷机理的研究进展

2 水杨酸诱导植物抗冷性的研究进展

2．1 SA对低温胁迫植物生理生化的影响

2．2 SA对冷胁迫植物基因表达的影响

3 mRNA差异显示的原理及其在植物抗冷性研究中的应用

3．1 mRNA差异显示的原理

3．2 mRNA差异显示在植物抗冷性中的应用

4 研究的目的与意义

研究内容

1 试验材料

1．1 植物材料

1．2 主要化学试剂

1．3 工具酶、引物等

1．4 试剂盒

1．5 主要仪器设备

1．6 菌株及克隆载体

1．7 溶液的配制

2 试验方法

2．1 总RNA的提取

2．2 总RNA的鉴定

2．3．总RNA的DNaseI处理

2．4 cDNA第一链合成

2．5 RT-PCR扩增

2．6 DDRT-PCR产物的尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析

2．7 cDNA差异片段的回收及二次扩增

2．8 反向Northern杂交

2．9 目标cDNA片段转化测序

2．10 EST质量检测及定量

3 结果与分析

3．1 总RNA质量检测及定量

3．2 DDRT-PCR产物的尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析

3．3 回收差异片段的重扩增

3．4 反向Northern杂交

3．5 酶切鉴定

3．6 序列测定结果

3．7 EST同源性对比

4 讨论

4．1 黄瓜幼苗的处理

4．2 黄瓜叶片总RNA的提取

4．3 mRNA差异显示技术

4．4 反向Nornthern杂交和假阳性

4．5 SA诱导的胁迫相关基因的特异性与广谱性

结论

参考文献

附录

致谢

声明