水貂生长激素基因重组腺病毒的构建

摘要

水貂是重要的经济动物之一，其皮毛具有很高的经济价值。水貂生长激素能够促进水貂生长，增加体长，提高毛皮质量。本研究利用基因工程技术，克隆带有信号肽序列的水貂生长激素基因，构建水貂生长激素基因重组腺病毒，为水貂促生长的研究提供新的科学手段。
　　 本研究主要包括腺病毒穿梭质粒构建、重组腺病毒质粒构建和重组腺病毒的包装和鉴定三方面的内容。
　　 首先利用PCR方法，以本室先前构建的携带有mGH的pCMVmGH质粒为模版，上、下游扩增引物末端分别加上KpnI、XbaI酶切位点，扩增mGH基因全长;然后将其插入到pEASY-Blunt Simple克隆载体，构建pEASY-Blunt Simple-mGH质粒;经酶切、测序鉴定正确后，用内切酶KpnI、XbaI酶切pEASY-Blunt Simple-mGH质粒，回收mGH片段并克隆至腺病毒转移质粒pShuttle-CMV上，构建穿梭质粒pShuttle-CMV-mGH，经酶切、测序鉴定正确后，用内切酶PmeI酶切pShuttle-CMV-mGH质粒使其线性化，然后转化至含有腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的BJ5183感受态细胞内进行同源重组，构建重组腺病毒质粒pAd-CMV-mGH，经酶切、PCR、测序鉴定正确后，用内切酶PacI酶切pAd-CMV-mGH质粒使其线性化，然后利用脂质体转染技术转染AD-293细胞进行重组腺病毒Ad-mGH的包装;并利用电镜检测、PCR、RT-PCR、测TCID50方法对Ad-mGH进行鉴定。
　　 PCR、限制性酶切、测序分析等结果证实，本研究成功将两端引入KpnI、XbaI酶切位点的目的基因mGH片段克隆至腺病毒穿梭质粒;携带目的基因mGH的腺病毒穿梭质粒与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1在大肠杆菌BJ5183内重组成功;利用脂质体转染技术成功的将重组腺病毒质粒pAd-CMV-mGH转移进AD-293细胞中;转染第10天，细胞出现变圆、肿胀、串珠状、葡萄串样等典型病变，80％左右的细胞死亡、漂浮;电镜检测、PCR、RT-PCR等结果证实，水貂生长激素基因重组腺病毒包装成功，并且能够正确转录目的基因;TCID50方法测得的第二代重组病毒Ad-mGH的滴度达到10-7.89/0.1ml;用包装出的重组腺病毒感染AD-293细胞，2-3d细胞出现变圆、肿胀、串珠状、葡萄串样等典型细胞病变，并且已经稳定传代至第十代，目的基因未丢失。
　　 以上结果表明，利用基因工程技术，克隆带有信号肽序列的水貂生长激素基因，能够成功构建水貂生长激素基因重组腺病毒。构建的重组腺病毒滴度较高，具有感染性，能正确转录目的基因，为水貂促生长的研究开辟了新的思路。

目录

摘要

缩略词表

引言

第一篇、文献综述

1 生长激素的研究进展

1．1 生长激素的结构

1．2 生长激素的功能

1．3 生长激素的作用机制

1．4 生长激素基因的研究进展

2．腺病毒及腺病毒载体的研究进展

2．1 腺病毒的概述

2．2 腺病毒载体的研究概况

3 水貂生长激素的研究进展

第二篇、研究内容

1 实验材料

1．1 质粒、菌株和包装细胞系

1．2 主要试剂及耗材

1．3 实验仪器

1．4 所用溶液及其配制

2 试验方法

2．1 目的基因的制备

2．2 重组穿梭质粒pShuttle-CMV-mGH的构建

2．3 重组腺病毒质粒pAd-CMV-mGH的构建

2．4 重组腺病毒Ad-mGH的包装和鉴定

3 结果与分析

3．1 目的基因mGH的克隆及鉴定

3．2 腺病毒穿梭质粒pShuttle-CMV-mGH的酶切鉴定

3．3 重组腺病毒质粒pAd-CMV-mGH的鉴定

3．4 重组腺病毒Ad-mGH的包装及鉴定结果

4 讨论

4．1 目的基因的制备

4．2 重组腺病毒穿梭质粒载体的构建

4．3 重组腺病毒质粒pAd-CMV-mGH的构建

4．4 重组腺病毒Ad-mGH的包装

结论

参考文献

致谢

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