德州驴H-FABP基因克隆及其mRNA在不同组织部位的表达差异

摘要

在驴的育种中肉质性状是一个重要的标志性指标，其中的一个重要的因素就是驴肉肌内脂肪的含量。脂肪是影响肉质性状的一个比较重要的因素，尤其是肌内脂肪被认为与肉质及口感呈正相关，会影响肉的嫩度、剪切力、风味和多汁性等。心脏脂肪酸结合蛋白(H-FABP)是脂肪酸结合蛋白家族中最普遍的一种类型，主要存在于心肌、骨骼肌和乳腺等对脂肪酸高度需求的组织中，其主要作用是防止细胞内堆积游离脂肪酸。目前，对多种畜禽的研究表明，H-FABP基因可作为影响畜禽肌内脂肪含量和肉质性状的侯选基因。尽管近十年来人们通过不断的选育来选择产肉率高，生长发育速度快的新品种，却忽视了肌内脂肪含量的选育。有研究表明驴肉肌内脂肪的含量应该在2％-3％较为合适，而德州驴和华北驴的肌肉含脂率分别为5.05％和5.31％，均超过此指标。本试验对德州驴H-FABP基因进行克隆测序，获得该基因的全序列;并分析该基因mRNA在不同组织部位的表达差异。以期为进一步开展德州驴H-FABP基因与其肉质性状的相关分析，进行分子标记辅助选择、基因定位、表达以及德州驴与其它物种间系统进化研究提供一定的理论基础。
　　 本研究对德州驴心脏脂肪酸结合蛋白(H-FABP)基因进行了克隆测序，并与GenBank中11个物种相应基因编码区核苷酸序列、氨基酸序列进行了比对分析。结果表明，德州驴H-FABP基因由4个外显子和3个内含子组成，外显子1、外显子2、外显子3和外显子4大小分别为73、173、102和57bp，内含子1、内含子2和内含子3大小分别为3500、1981和1499bp。CDS序列全长为405bp，前体氨基酸数为134个。物种间在该基因核苷酸序列上有较高的保守性。通过最小进化法(ME法)、邻接法（NJ法）和非加权组平均法（UPGMA法）用H-FABP基因编码区核苷酸序列构建的物种间分子系统进化树，结果表明，3种方法构建的物种间分子系统进化树基本一致。并且三种分子进化树结果与动物学分类一致，表明H-FABP基因适合于构建不同物种间的系统进化树。
　　 德州驴H-FABPmRNA在心脏、背最长肌、腿部肌肉、脂肪、肺、肝、脾、肾八个组织均有表达，其中心脏中的表达量最高，其在不同部位的表达量的关系总体来说为:心脏＞脂肪＞肝＞肺＞腿＞脾＞背＞肾。说明H-FABP基因较高地表达于心脏、脂肪组织和肝脏，低表达于肾脏组织，脂肪组织和肝脏中基因表达有个体特异性。

目录

摘要

英文缩写词表

前言

1．本研究的目的及意义

2．文献综述

2．1 驴的起源问题

2．2 我国驴种的分布及生态特点

2．3 肌内脂肪(IMF)

2．4 FABPs家族及其基因结构的研究进展

2．5 实时荧光定量反转录PCR(FQRT-PCR)技术及其应用

第一部分 德州驴心脏脂肪酸结合蛋白(H-FABP)基因的克隆及序列分析

1．试验材料

1．1 试验动物

1．2 试验仪器设备

1．3 主要试验试剂及工具酶

1．4 主要试剂和溶液的配置

2．试验方法

2．1 引物的设计与合成

2．2 DNA的提取与分离

2．3 分光光度法检测DNA

2．4 德州驴H-FABP基因的PCR扩增

2．5 德州驴H-FABP基因目的片段的纯化回收

2．6 PCR产物的克隆

2．7 测序及测序结果分析

3．结果与分析

3．1 德州驴H-FABP基因的PCR扩增

3．2 德州驴H-FABP基因的结构

3．3 德州驴与其它物种间H-FABP基因编码区核苷酸序列比较分析

3．4 德州驴与其他物种间H-FABP基因编码区核苷酸分子系统进化

3．5 德州驴与其它物种H-FABP氨基酸序列间比较分析

4 讨论

4．1 德州驴H-FABP基因的结构特征

4．2 德州驴H-FABP编码区核苷酸序列与其它物种的比较

4．3 德州驴H-FABP氨基酸序列与其它物种的比较

第二部分 H-FABP基因mRNA的在德州驴不同组织部位表达差异分析

1．试验材料

1．1 实验动物

1．2 实验仪器设备

1．3 主要实验试剂及工具酶

1．4 主要试剂和溶液的配制

2．实验方法

2．1 德州驴GAPDH基因引物设计与合成

2．2 德州驴GAPDH基因PCR扩增

2．3 Trizol法提取组织RNA

2．4 反转录，cDNA第一链的获得

2．5 定量PCR

3．结果与分析

3．1 各个组织中RNA提取结果

3．2 德州驴GAPDH基因的扩增结果

3．3 德州驴H-FABP基N在组织中的表达量检测

4．讨论

4．1 德州驴与马的亲缘性

4．2 组织RNA提取

4．3 德州驴H-FABP基因的组织表达规律

结论

参考文献

致谢

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