奶牛乳腺上皮细胞电穿孔法转染乳铁素H基因的研究

摘要

本试验通过建立奶牛乳腺上皮细胞(bovinemammaryepithelialcells，BMEC)分离培养体系，研究奶牛乳腺上皮细胞的生物学特性;构建乳铁素H真核表达载体，提高转基因的效率;利用电穿孑乙转基因方法将乳铁素H（LactoferricinHuman，Lfcin-H）基因转入奶牛乳腺上皮细胞，获得转基因克隆牛供体细胞，对转染的细胞进行分子生物学检测，为奶牛乳腺生物反应器的研究奠定基础，试验取得以下结果:
　　 1、通过贴壁筛选法分离培养奶牛乳腺上皮细胞，观察其生长特性，经传代纯化，绘制P5代细胞生长曲线，细胞可以稳定传代至15代保持未分化状态且染色体核型正常。
　　 2、采用RT-PCR方法从奶牛乳腺组织扩增同源重组引导序列左右臂HRDS1和HRDS2片段，将其克隆到真核表达载体pEGFP-N3-tPA上，构建乳铁素H真核表达载体pCAM，对重组质粒进行测序鉴定。
　　 3、分别采用500、700、900和1100V/cm和1、5、10、和15ms的参数组合，将线性化的带有新霉素抗性、卡那霉素抗性和绿色荧光蛋白三重筛选标记的乳铁素H乳腺特异表达载体pCAM电穿孔转入体外培养的P5代奶牛乳腺上皮细胞，经800μg/mL(G418筛选1周，300μg/mLG418和10μg/mLGCV筛选1周后扩大培养2～3代，在场强700V/cm，脉冲时程5ms，DNA4μg，细胞密度106～107个/mL条件下，转染处于对数生长期的P5代细胞效果最佳，取部分筛选后的细胞进行PCR检测得到预期条带。
　　 本研究结果显示:获得了高纯度且增殖能力较强的奶牛乳腺上皮细胞，体外传代15次后核型未发生改变;PCR克隆出奶牛乳腺组织HRDS1和HRDS2片段，重组阳性克隆测序鉴定证实目的片段已正确插入pEGFP-N3-tPA载体，构建了乳铁素H真核表达载体pCAM;转染后24～48h在荧光镜下检测各组均可观察到绿色荧光表达，筛选后各组克隆形成数以700V/cm和5ms组最多，PCR检测得到了预期条带。

目录

摘要

中英文对照缩略词

第一部分 文献综述

1 奶牛乳腺上皮细胞的研究进展

1．1 奶牛乳腺上皮细胞的形态特征

1．2 奶牛乳腺上皮细胞的增殖分化特性

1．3 乳腺上皮细胞特异性分泌蛋白-酪蛋白

1．4 乳腺上皮细胞作为工程细胞的优越性及研究意义

2．电穿孔转基因的研究进展

2．1 电穿孔法的基本原理

2．2 细胞电穿孔方法表达抗茵肽的优点

3．乳铁素H的应用

3．1 乳铁素H的作用机理

3．2 乳铁素的生物学活性

3．3 乳铁素的纯化

3．4 乳铁素的应用

4 乳腺生物反应器的研究进展

4．1 动物乳腺生物反应器的研究进展

4．2 转基因动物乳腺生物反应器的原理

4．3 转基因动物乳腺生物反应器的优点

4．4 转基因动物乳腺生物反应器存在的问题

4．5 转基因动物乳腺生物反应器的应用前景

第二部分 试验研究

试验一 奶牛乳腺上皮细胞的分离培养及其生物学特性检测

1 试验材料

2 试验方法

3 结果

4．讨论

试验二 乳铁素H真核表达载体的构建

1 试验材料

2 试验方法

3．结果

4．讨论

试验三 奶牛乳腺上皮细胞电穿孔法转染乳铁素H基因的研究

1 试验材料

2 试验方法

3 试验结果

4 讨论

结论

参考文献

附录

附录A 主要试剂

附录B 试验仪器

附录C 主要溶液配制方法

附录D 细胞冷冻和复苏方法

致谢

声明