花脸香蘑发酵液多糖的分离纯化及活性测定

摘要

花脸香蘑味道鲜美，色泽美丽，气味浓香，是一种品质优良的食用菌，为开发利用这一资源，对花脸香蘑生物学特性进行了研究，结果表明:菌丝体生长最佳碳源为玉米面;最佳氮源为黄豆粉;分别加入KH2PO4和K2HPO4时菌丝体生长均较好，但同时加入MgSO40.05％，KH2PO40.1％菌丝体生长情况最好;碳氮比为20/1时，菌丝体达到最佳生长状态;不添加维生素时菌丝体生长情况最佳;在pH7、pH8、pH9时菌丝体生长状态较好;最适光质条件为自然光;光量试验结果显示，黑暗条件下菌丝体生长状态最佳。经正交试验结果确定菌丝体生长的最佳固体培养基为:蔗糖20g、豆粉6g、MgSO40.5g，KH2PO41g，蒸馏水1000ml。
　　 为了提高花脸香蘑菌丝体发酵的产糖率，采用热水浸提法，以发酵全液粗多糖得率作为考核指标，通过单因素试验和正交试验，对花脸香蘑(Lepistasordida(Fr.)Sing.)菌丝体多糖发酵条件进行优化。结果表明，花脸香蘑菌丝体多糖发酵的最佳条件为:蔗糖20g、蛋白胨4g、硫酸镁0.5g、磷酸二氢钾2g，蒸馏水1000ml。
　　 通过单因素试验和正交试验，研究了提取温度、醇沉酒精浓度、pH、提取次数对多糖提取量的影响。单因素试验结果表明:最佳提取温度、酒精终浓度、pH、提取次数依次为100℃、80％、12、3次。正交试验结果显示，花脸香蘑发酵液多糖的最佳提取条件为:温度100℃、2次、pH12、酒精浓度70‰花脸香蘑发酵液多糖提取量达4mg/ml。
　　 发酵液经热水浸提后，醇沉得粗提物LSC，粗提物含有多糖、蛋白质、色素、小分子等多种物质，为了得到较为纯化的多糖样品，对粗提物进行初步纯化和分级纯化。初步纯化过程包括sevag法除蛋白，双氧水法除色素，利用透析袋透析除小分物质，样品冷冻干燥，最终得到样品LSP。利用葡聚糖凝胶G-100柱层析，对样品LSP进行分级纯化，将多糖高峰部分分别合并得LSM1和LSM2。在多糖的提取、分离纯化过程中共得四种样品:粗多糖LSC，经初步分离纯化的多糖LSP，纯多糖LSM1和LSM2。LSC、LSP、LSM1、LSM2在抗肿瘤试验中做供试样品。
　　 关于花脸香蘑多糖单糖组分及分子量的研究发现，花脸香蘑多糖LSM1含有甘露糖、盐酸氨基葡萄糖、葡萄糖、岩藻糖、木糖5种单糖，摩尔比为1.00∶0.21∶2.24∶0.48∶0.11，据重均分子量确定其分子量分布在5697.59-1105945.03之间。
　　 LSM2由甘露糖、盐酸氨基葡萄糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、岩藻糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖8种单糖组成，其摩尔比为1.000∶0.017∶0.021∶3.552∶0.114∶0.030∶0.053∶0.151，以重均分子量为依据判定其分子量分布在2148.27-14165.97。
　　 红外光谱测定结果显示，LSM1和LSM2均为吡喃糖。
　　 核磁共振图谱分析结果显示，LSM1糖苷键类型有α构型及β构型，连接方式主要为1，4-糖苷键。LSM2糖苷键以α构型为主，包含β构型，连接方式主要为1，4-糖苷键。
　　 对花脸香蘑多糖进行体内抗肿瘤试验，研究结果显示，花脸香蘑多糖样品具有不同程度的抑瘤效果，粗多糖中剂量组、初步纯化后的多糖LSP高剂量组、中剂量组，抑瘤效果较好，抑瘤率依次为47.8％、65％、57％。

目录

摘要

1 前言

1．1 花脸香蘑研究进展

1．2 多糖的研究概况

1．3 食用菌多糖的提取

1．4 食用菌多糖的分离纯化

1．4．1 初步纯化

1．4．2 多糖的分级纯化

1．5 食用菌多糖纯度鉴定

1．6 食用菌多糖的测定

1．6．1 单糖组分测定及分子量测定

1．6．2 多糖含量测定

1．7 食用菌多糖的结构鉴定

1．7．1 化学方法测定多糖结构

1．7．2 物理分析法

1．8 食用菌多糖的生物活性

2 花脸香蘑菌丝体培养特性的研究

2．1 材料与方法

2．1．1 材料

2．1．2 供试培养基

2．1．3 花脸香蘑菌丝体营养条件研究

2．1．4 不同pH对花脸香蘑菌丝体生长的影响

2．1．5 正交试验

2．2 结果

2．2．1 花脸香蘑菌丝体营养条件研究

2．2．2 pH对菌丝生长的影响

2．2．3 正交试验

2．3 讨论

3 花脸香蘑菌丝体发酵条件的研究

3．1 材料与方法

3．1．1 材料

3．1．2 药品与仪器

3．1．3 不同营养源对菌丝体发酵的影响

3．1．4 不同pH的筛选

3．1．5 正交试验筛选培养基

3．1．6 发酵液制备

3．1．7 多糖提取

3．1．8 数据处理

3．2 结果

3．2．1 不同营养源对菌丝体发酵的影响

3．2．2 pH对菌丝体发酵的影响

3．2．3 正交试验

3．3 讨论

4 花脸香蘑发酵全液多糖提取条件的研究

4．1 材料与方法

4．1．1 材料

4．1．2 试剂与仪器

4．1．3 多糖提取基本条件

4．1．4 单因素试验

4．1．5 正交试验

4．2 结果

4．2．1 单因素试验

4．2．2 正交试验

4．3 讨论

5 花脸香蘑多糖的分离纯化

5．1 材料与方法

5．1．1 材料

5．1．2 试剂与仪器

5．1．3 初步分离纯化

5．1．4 分级纯化

5．2 结果

5．2．1 初步分离初化

5．2．2 分级纯化

5．3 讨论

6 花脸香蘑多糖结构的初步研究

6．1 材料与方法

6．1．1 材料

6．1．2 药品与仪器

6．1．3 单糖组分的测定

6．1．4 分子量测定

6．1．5 紫外光谱分析

6．1．6 红外光谱分析

6．1．6 核磁共振图谱分析

6．2 结果

6．2．1 单糖组成测定结果

6．2．2 分子量大小及分布

6．2．3 紫外扫描结果

6．2．4 红外光谱扫描

6．2．5 核磁共振图谱

6．3 讨论

7 花脸香蘑多糖抗肿瘤作用的研究

7．1 材料与方法

7．1．1 材料

7．1．2 药品与仪器

7．1．3 实验动物及细胞

7．1．4 实验方法

7．2 结果

7．3 讨论

8 结论及进一步研究的意义

8．1 结论

8．2 进一步研究的意义

参考文献

附录

致谢

声明