水貂α和β干扰素基因的克隆表达及活性分析

摘要

干扰素是在特定的诱生剂作用下由淋巴细胞分泌的具有抗病毒、影响细胞生长分化、抗肿瘤和调节免疫功能等活性的糖蛋白。在动物体内自身存在的干扰素极其微量，以传统的方法难以制备和纯化，因此利用基因工程技术生产重组干扰素是解决这一难题的有效途径。
　　 根据Genebank上报道的水貂IFN-α和IFN-β序列设计引物，以新鲜水貂肝脏提取的总基因组为模板经PCR扩增出IFN-α基因约564bp和和IFN-β基因约561bp两个片段，按常规方法克隆到pMD-18T载体，经蓝白斑筛选和酶切分析获得阳性重组质粒，并进一步对两片段进行序列分析。分别设计了一对扩增IFN-α基因和IFN-β基因成熟肽的引物，在引物的上下游分别带有EcoRⅠ、Xho(l)Ⅰ酶切位点，以pMD-IFN-α和pMD-IFN-β为模板，通过PCR扩增获得目的片段并且进行回收，用相同的限制性内切酶酶切表达载体pET32a后构建重组表达载体pET32a-IFN-α和pET32a-IFN-β，并转入E.coliDH5α中，得到基因工程菌，经酶切和测序鉴定证明克隆到载体pET32a上的外源基因即为水貂IFN-α和IFN-β成熟肽基因。将重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)中进行IPTG诱导表达。表达产物进行SDS-PAGE与Westernblot鉴定，可产生相对分子量约为36KDa和34KDa的表达产物，表明成功地建立了IFN-α和IFN-β蛋白的重组表达系统。
　　 对表达的蛋白运用尿素洗涤的方法进行纯化，并通过细胞病变抑制法测定干扰素的抗病毒活性，结果显示IFN-α和IFN-β均在MDCK细胞上对VSV具有一定的的抗病毒活性。

目录

摘要

英文缩写词表

第一章 文献综述

1 干扰素的分类与组织细胞来源

2 干扰素的分子结构

3 干扰素的一般特性

4 干扰素的产生及其调控

5 干扰素的作用机理

6 干扰素的生物学作用

7 国内外应用现状

8 试验目的及意义

试验一 水貂IFN-α 和IFN-β基因的克隆与序列分析

1 材料

2 方法

3 结果与分析

4 讨论

5 小结

试验二 水貂IFN-α和IFN-β基因的原核表达及活性测定

1．材料

2 方法

3 结果与分析

4 讨论

5 小结

全文总结

参考文献

附录

致谢

读硕士期间发表的论文

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