水貂γ-干扰素单克隆抗体及其在检测水貂γ-干扰素中的应用

摘要

本发明公开了一种水貂γ-干扰素单克隆抗体及其在检测水貂γ-干扰素中的应用。在本发明中，所述的水貂γ-干扰素单克隆抗体由保藏号为CGMCC？No.10953的杂交瘤细胞株分泌产生，研究表明由该杂交瘤细胞株分泌产生的单克隆抗体能够同时识别原核表达产物和真核表达产物，且与天然IFN-γ的结合效价高，特异性好。此外，本发明还公开了一种以筛选的特异性单抗为包被抗体，多抗为检测抗体建立的夹心ELISA检测方法，实验证明该方法灵敏度、准确率高，特异性良好。因此，本发明的提出对于对水貂病毒感染及疫苗免疫后机体细胞免疫水平的评价以及特种动物的疫病防控具有重要意义。

说明书

技术领域

本发明涉及一种水貂γ-干扰素单克隆抗体的制备，还涉及一种检测水貂γ-干扰素的ELISA检测方法。本发明属于生物技术领域。

背景技术

大多数细胞因子是免疫应答的产物，在动物和人体内可发挥免疫学效应，最终通过上调免疫细胞对抗原物质的免疫应答，介导炎症反应而清除抗原物质。抗原刺激和病原微生物感染均可诱导体内产生细胞因子，因此细胞因子与疾病的发生、发展有着密切的关系，它们可参与疾病的发生、发展。因此细胞因子在疾病的诊断、治疗、预防等方面有着广泛的应用。

细胞因子可以导致和/或促进某些疾病的发生，病原微生物感染可诱导某些细胞因子过量产生，高浓度细胞因子可加剧感染症状，因此临床上通过检测一些细胞因子可以对疾病进行诊断。近年来，动物细胞因子的研究也越来越受到重视，采用基因工程技术开发出一些重组细胞因子产品(如干扰素)。其主要应用表现在：通过检测细胞因子水平来评价动物机体的免疫功能状态，其次也可以研究细胞因子在病原微生物感染，特别是一些持续性感染疾病、免疫抑制性疾病中的作用和地位。

干扰素(interferon，IFN)是1957年最早发现的细胞因子，因其能干扰病毒感染而得名。干扰素(IFN)等细胞因子可诱导APC表达MHCⅡ类分子，从而促进抗原递呈作用。30年前，IFN-γ最早被发现，于1982年被克隆。其仅由NK细胞、CD8+T细胞和CD4+T细胞Th1亚群产生，通过广泛表达的特异性受体(除了红细胞上不表达)发挥作用，血小板上也表达IFN-γ受体，为IFN-γ在血循环中的运输增加了可能性。

Th1细胞分泌IL-2，IFN-γ及淋巴毒素，Th1细胞功能与细胞介导的免疫应答(炎症反应，迟发型超敏反应及细胞毒作用)相关。与TDTH细胞、TC细胞增殖、分化、成熟有关，因此Th1细胞可促进细胞介导的免疫应答，其中IFN-γ是细胞免疫状态监测的重要指标。因此，检测IFN-γ转录因子水平，可以间接地反映出IFN-γ基因表达水平，从而为研究Th1细胞分化及其在自身免疫性疾病，病毒感染中的作用有着重要的临床和科研意义。

对样本中的IFN-γ进行定量分析，在免疫机制研究、免疫功能分析、疫苗免疫效果评估、器官移植、过敏反应以及多种胞内病原感染的诊断等方面都具有极其重要的理论价值和应用价值。评价IFN-γ在机体内的动态变化水平指标，对于了解传染性疾病的发生、发展、转归情况及其机体保护性免疫反应动态规律提供较大帮助。因此，建立评价IFN-γ在机体中水平变化的检测方法显得十分重要。

近年来，我国水貂、狐狸和貉对犬瘟热，细小病毒和阿留申病毒混合感染趋势上升，而传统疫苗免疫后保护率下降时有发生，这些是什么原因导致的，除了病毒的不断变异外，了解动物机体的免疫状态，也为免疫程序的优化及免疫时间的选择提供依据。因此，本发明的提出为开发具有自主知识产权的新型检测方法对于我国特种动物疫病防控具有深刻的现实意义与广阔的应用前景。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是应用杂交瘤技术获得稳定分泌抗水貂γ-干扰素单克隆抗体的杂交瘤细胞株，同时建立水貂γ-干扰素的检测方法，从而为水貂γ-干扰素的检测提供一种新的技术手段，也为研究机体的免疫状态及免疫机制提供技术平台。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：

基于抗原特异性的IFN-γ反应可用于评价机体特异性细胞免疫状态的原理，特异性抗原刺激的外周血淋巴细胞IFN-γ体外释放试验已被广泛用于抗感染诊断和细胞免疫状态评价。这种诊断方法是以IFN-γ单克隆抗体为基础建立的一种夹心ELISA。将外周血淋巴细胞与特异性抗原共同孵育过夜，通过夹心ELISA检测培养上清中的IFN-γ浓度以诊断特异性感染。为了进一步将IFN-γ应用于水貂病毒感染的诊断和细胞免疫评价，本发明进行了单克隆抗体研制：以组氨酸标记的重组IFN-γ为抗原免疫小鼠，通过经典的杂交瘤技术，获得5株能稳定分泌高效价单克隆抗体的杂交瘤细胞系，利用这些细胞分别诱生了腹水。通过ELISA、Westernblot与免疫荧光证明，其中一株杂交瘤细胞所生产的单克隆抗体可识别天然的IFN-γ，且与IFN-γ结合效价高，特异性好，在水貂性疾病诊断中具有重要的应用前景。

所述杂交瘤细胞株命名为MiIFN-γ-H44，其分类命名为分泌水貂γ-干扰素单克隆抗体杂交瘤细胞株，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所，其菌种保藏编号为：CGMCCNo.10953，保藏日期为2015年7月2日。

进一步的，本发明还提出了由所述的杂交瘤细胞株所分泌的抗水貂γ-干扰素的单克隆抗体以及所述的单克隆抗体在制备检测水貂γ-干扰素试剂中的应用，实验证明所述单克隆抗体能够同时可识别天然水貂γ-干扰素。

更进一步的，本发明还提出了一种用于检测水貂γ-干扰素的ELISA检测试剂盒，其特征在于含有本发明所述的单克隆抗体、抗γ-干扰素的多克隆抗体以及HRP标记的羊抗兔IgG酶标二抗。

在本发明中，优选的，所述的单克隆抗体为包被抗体，所述的多克隆抗体为检测抗体，当包被抗体的浓度为0.0118μg/ml，检测抗体的浓度为0.126μg/ml时可检测到0.1ug的水貂IFN-γ，100倍再稀释时，OD值仍能达到0.8。

本发明以筛选的特异性单抗为包被抗体，多抗为夹心抗体，建立的夹心ELISA检测方法检测了犬瘟热感染水貂外周血淋巴细胞分泌IFN-γ蛋白水平，通过三次符合实验，验证该方法灵敏，准确率高，同时所建立的夹心ELISA对几种非相关性抗原的检测均为阴性，表明该方法的特异性良好。由于目前市场上很难买到天然水貂IFN-γ，所以本研究应用的标准品及生产抗体用的抗原均为重组蛋白。但初步研究证明，所研制的水貂IFN-γ单克隆抗体与多克隆抗体及建立的夹心ELISA同样适应于免疫细胞天然分泌的IFN-γ。用该夹心ELISA方法测定了分别感染犬瘟热疫苗株和强毒株的水貂外周血淋巴细胞培养上清，在6个不同时间点，IFN-γ水平随着感染时间的变化而变化，在感染初期，IFN-γ在24小时前表现为表达抑制，48h表达水平达到最高峰，72h急剧下降。本发明的提出对特种动物疫病防控具有重要意义。

附图说明

图1为水貂IFN-γ的基因序列(划线部分为信号肽区)；

图2为水貂IFN-γ在大肠杆菌中的可溶性表达；

MK：蛋白分子量标准；A、未诱导对照；B、表达全菌；C、裂解物上清；D.裂解物沉淀；

图3为杂交瘤上清检测大肠杆菌表达；

1、蛋白分子量标准；2，3、编号为31G的杂交瘤上清检测pET32a-IFN-γ和pCold-IFN-γ表达；4、编号为31G的杂交瘤上清检测pET32a-IFN-α；5，6、编号为31A的杂交瘤上清检测pET32a-IFN-γ和pCold-IFN-γ表达；7、编号为31A的杂交瘤上清检测pET32a-IFN-α；8，9、编号为31B的杂交瘤上清检测pET32a-IFN-γ和pCold-IFN-γ表达；10、编号为31B的杂交瘤上清检测pET32a-IFN-α；11，12、编号为H44的杂交瘤上清检测pET32a-IFN-γ和pCold-IFN-γ表达；13、编号为H44的杂交瘤上清检测pET32a-IFN-α；14，15、编号为F46的杂交瘤上清检测pET32a-IFN-γ和pCold-IFN-γ表达；16、编号为F46的杂交瘤上清检测pET32a-IFN-α；

图4为杂交瘤上清免疫荧光检测pcDNA3.1/MiIFN-γ在Vero细胞上的表达；

A、编号为H44的杂交瘤上清10倍稀释后免疫荧光检测；B、编号为F46的杂交瘤上清10倍稀释后免疫荧光检测；C、报告基因对照；D、正常细胞对照；

图5为SDS-PAGE检测纯化的IFN-γ单克隆抗体；

1、蛋白分子量标准；2，3、编号为H44纯化抗体；4，5、编号为F46纯化抗体；

图6为淋巴细胞在感染0h、3h、8h、24h、48h、72h和96h后表达的γ-干扰素水平。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

本发明具体实施例所涉及的主要材料和来源

pMD18-T载体，原核表达载体pColdⅡ，各种限制性内切酶和DH5α感受态细胞购自TaKaRa(大连)有限公司。SPF级Balb/c小鼠购自长春生物制品研究所实验动物中心；小鼠骨髓瘤细胞SP2/0本实验室制备；RPMI-1640培养基、澳大利亚血缘胎牛血清购自Gibco公司；HAT选择培养基、HT培养基和PEG5000购自Sigma公司；辣根过氧化物酶HRP标记的山羊抗鼠IgG，荧光二抗和TMB底物显色液购自Sigma公司；ECL发光试剂盒购自Pierce公司；预染蛋白Marker购自Thermo公司；变性蛋白凝胶制备试剂盒购自碧云天生物技术研究所，血清培养基、液体石蜡、生理盐水，HiTraprProteinGHP(GEHealthcare17-0404-03)。6月龄健康水貂购自中国农业科学院特产研究所动物实验基地。

实施例1抗水貂γ-干扰素单克隆抗体的制备

1、方法

1.1、水貂外周血淋巴细胞的制备及IFN-γ诱生

无菌采取健康水貂外周抗凝血5mL，加入RPMI1640培养液1:1稀释。取5mL稀释的外周血缓慢加入5mL人用淋巴细胞分离液，室温下2000r/min水平转子离心40min。用灭菌长针头将白细胞层移于另一试管，用RPMI1640培养液洗涤细胞2次，细胞用含25μg/mLPHA和10％小牛血清的RPMI1640培养液悬浮，取细胞悬液计数，按计数结果将细胞悬液稀释至1×10⁶个/mL浓度，置24孔细胞培养板中，37℃CO₂培养箱培养24h。

1.2、RT-PCR扩增MiIFN-γ基因

根据GenBank上发表的雪貂IFN-γcDNA全序列(Genebank登录号:EF492064)设计扩增引物，引物序列为:

上游引物：5′-ATGAATCACAAAGTGCA-3′

下游引物：5′-TTATTTCGATGCTCTG-3′；

根据扩增的结果设计构建原核表达mMiIFN-γ基因扩增引物:

上游引物：

5′-GTGCATCATCATCATCATCATATGGATGACGACGATAAGGGCTATTACTG

TCAGGCCATG-3′(下划线为NdeⅠ酶切点)；

下游引物：

5′-CTAGACTGCAGGTCGACAAGCTTTTATTTCGATGCTCTGCGGC-3′(下划线为HindⅢ酶切位点)。

1.3、水貂IFN-γcDNA的扩增

在9.5μL的RNA溶液中加入1μLOligo(dT)15引物(50pmol/μL)，混匀后置70℃水浴锅作用5min后立即冷却，依次加入10mmol/LdNTP5μL，AMVBuffer4μL，RNaseInhibitor0.5μL，AMV1μL充分混匀后置PCR仪上42℃1h，95℃3min灭活反转录酶，冷却后直接用于PCR反应。PCR反应体系:10×ExTaqBuffer2.5μL，2.5mmol/μLdNTP2μL，上、下游引物(25pmol/μL)各1μL，ExTaqDNA聚合酶(2u/μL)0.125μL，加灭菌去离子水补足25μL。反应液混匀后，于PCR仪上进行扩增，循环参数为95℃预变性5min，94℃45s，52.5℃1min，72℃1min，32个循环后72℃延伸6min，扩增完毕后，取6μL于1.5％琼脂糖凝胶电泳观察结果。

1.4、表达载体构建及表达

将扩增得到的水貂IFN-γcDNA基因克隆到pMD18-T载体中，经酶切及PCR鉴定正确后进行测序；以正确的目的基因序列为模版设计扩增IFN-γ成熟肽基因的引物，上下游引物分别引入NdeI和HindⅢ酶切位点，将酶切后的PCR产物与pCold载体连接，转化BL21感受态菌，随机挑取单个克隆菌株进行进一步鉴定。阳性重组菌pCold-MiIFN-γ/DH5α转接种氨苄LB培养基，于37℃振荡培养过夜，次日以1:100转接种氨苄2YT，于37℃振荡培养至OD600值达0.4～0.6时，15℃放置30min。经0.5mmoL/LIPTG，15℃低温诱导24h，收集菌体，超声波裂解，4℃离心收集上清。然后对表达产物进行SDS-PAGE电泳分析。

1.5重组蛋白纯化

可溶性重组蛋白的纯化参照GE公司镍离子亲和层析柱(Ni-NTA)操作说明进行，离心收集的表达菌体用20MmNa3PO4，0.5MNaCl，20mM咪唑，pH7.4结合缓冲液重悬，超声裂解至澄清，12000rpm离心10min，取上清用0.22μm无菌滤膜过滤。超声后收集上清，用GE公司的Ni-NTA1ml预装柱亲和层析纯化，用含20mMNa3PO4，0.5MNaCl，500mM咪唑，pH7.4洗脱液洗脱，取不同峰值样品进行SDS-PAGE，经过检测纯度达到90％。

1.5、动物免疫

纯化后的蛋白用BCA定量试剂盒进行蛋白定量。第一次免疫，重组蛋白和等体积的弗氏完全佐剂，乳化完全，皮下多点注射，初次免疫20μg/只；3周后，二次免疫20μg/只，皮下多点注射；3周后，第三次免疫皮下多点注射；一周内测定其效价，3d后进行细胞融合。

1.6间接ELISA检测方法的建立及免疫效价测定

三免一周后断尾采血，37℃静置半小时，4℃冰箱存放2h，10000rpm离心10min，收集血清，采用间接ELISA方阵滴定法确定抗原、抗体的最佳稀释度，步骤如下：

①包被抗原浓度的确定：用碳酸钠-碳酸氢钠，pH9.6包被液稀释重组蛋白，重组蛋白浓度为400μg/ml，以10倍稀释浓度为初始浓度按2¹、2²、2³、2⁴、2⁵、2⁶、2⁷、2⁸、2⁹、2¹⁰、2¹¹、2¹²倍梯度稀释，100μl/孔，加入酶标板中，37℃温育2h，用洗板机洗3次，每次5min。

②2％脱脂奶粉PBS封闭液封闭，200μl/孔，37℃孵箱，2h；后用洗液洗涤3次。

③加入一抗(细胞培养上清)、阴性对照(SP2/0培养上清)、空白对照(PBS)、阳性对照(阳性血清PBS200倍稀释)，均为100μl/孔，37℃孵箱，1h；后用洗液洗涤3次。

④加入PBS稀释山羊抗小鼠IgG/HRP20000倍的二抗，100μl/孔，37℃孵箱1h；取出后用洗液洗涤3次。

⑤显色，显色液100μl/孔，显色时间为5min左右。每孔加入50ul终止液终止。测定450nm吸光值，记录保存数据。

1.7细胞融合

1.7.1实验器材

灭菌的手术器械：剪刀、镊子、细胞筛、注射器内芯、无菌平皿。湿盒，500ml烧杯，50ml离心管，15ml离心管。

1.7.2实验试剂

含15％血清IMDM完全培养基(Gibco)；2.2％甲基纤维素(SIGMA)；新生牛血清PEG1500(Roche)；HAT和HT(Sigma)。

1.7.3实验步骤

①将状态良好的sp2/0细胞轻柔的从培养瓶壁上吹打下来，吸入到50ml离心管中。

②小鼠摘眼球取血，然后拉颈处死，放入75％的酒精中浸泡5min。

③在平皿中倒入少量无血清的IMDM，将细胞筛及注射器内芯放入平皿中。用剪刀和镊子取下小鼠的脾脏，放到细胞筛上。用注射器的内芯轻轻地将脾充分碾碎，将碾好的细胞吸入到装sp2/0的离心管中，离心1500rad/min，5min。

④用剪刀和镊子取下小鼠的胸腺，碾碎。将碾好的胸腺细胞放到15ml离心管中，再加入2ml的HAT，2ml的HT放在孵箱中备用。

⑤将离心好的细胞，倒掉上清，用无血清的IMDM将细胞小心轻柔地吹匀，离心(1500rad/min，5min)。

⑥将离心好的细胞上清尽量倒掉。拍打离心管底充分悬浮细胞，将离心管放入37℃温水中，在1分钟内缓慢加入1ml的PEG，加完后，在温水中静置1min。然后2min内缓慢加入2ml的无血清的IMDM，接着2min内缓慢加入8ml无血清的IMDM。离心1000rad/min，5min。

⑦倒掉上清，加入10ml的血清，小心的将细胞吹匀，倒入前面准备好的胸腺细胞。再加入25ml灭过菌的半固体培养基，充分混匀。然后均匀倒入30个细胞培养皿中。将细胞培养皿放入湿盒中，然后放入孵箱中培养。挑取细胞单克隆，培养于96孔细胞培养板(事先用胸腺细胞铺板，100ul/孔)。用1μg/ml可溶性重组蛋白包板，对挑选的克隆采用ELISA方法，做第一次筛选，得到66株阳性杂交瘤细胞株，第二次筛选获得24株阳性杂交瘤细胞株。

1.8、单抗亚类鉴定：

应用SBAClonotypingSystem-HRP试剂盒鉴定单克隆抗体亚型。称取15mgABTS固体溶于去离子水，避光保存于2-8℃，1mLGoatAnti-MouseIgcaptureantibody(2.5mg/mL)用pH7.4的PBS稀释成浓度5-10μg/ml，于ELISA板中每孔100μl，盖上盖子后，于4℃过夜。用含0.05％Tween的PBS洗板3次，再于每孔加入100μl含1％的BSA的PBS，于室温孵育1h。洗板3次，于每孔加入100μl细胞上清，至于室温下震荡1h。洗板3次，加入HRP标记的抗体每孔100μl，于室温震荡1h。洗板5次。准备基底液：称取525mg柠檬酸溶于50ml水中，用3MNaOH调pH到4.0。取10ml配制的柠檬酸盐，加入0.2ml的ABTS与10μl30％的H2O2，于每孔中加入100μl基底液，10-20min后于405nm读数。

1.9单克隆抗体纯化

腹水的制备参照刘秀梵等报道的方法进行：(1)6孔细胞培养板，每孔中加入细胞培养液约2ml。(2)从液氮中取出细胞，放入37℃水浴锅中迅速解冻。(3)吸取细胞放入5-10ml完全培养基，1000rpm离心5min，弃掉上清。(4)将离心好的细胞上清液吸除，吸取1ml细胞培养液混匀沉淀细胞，将该细胞液吸出，混匀到相应的培养板孔中，放入细胞培养箱中进行孵育。将冻存的杂交瘤细胞复苏，大量扩大培养，待细胞生长至对数生长期，离心去上清，用细胞培养液洗涤一次沉淀的细胞，作适当稀释，5×105个细胞，注入6～8周龄，7d前预先腹腔注射液体石蜡的Balb/c鼠，7～10d后，选出腹部明显隆起的Balb/c鼠，采集腹水，离心后取上清。上清液按照以下方法处理：

①样本预处理：用相应的偶联缓冲液以1:3稀释，配平，10000rpm4℃离心20min，0.22μm滤膜过滤，除去脂肪、细胞残渣及小颗粒物质。

②平衡：用5-10倍柱体积的相应偶联缓冲液平衡预装亲和柱，保持流速为4s/滴。

③上样：用注射器把样品注入柱子上端接口，收集流出液于50ml离心管中，保持流速为5s/滴。

④洗杂：用5倍柱体积的偶联缓冲液过柱，保持流速为4s/滴。避免过度洗涤，如果目的蛋白和配体的相互作用很弱，过度洗涤会降低得率。

⑤洗脱：用5倍柱体积洗脱缓冲液洗脱抗体，收集于上述EP管中。

⑥再生：用5倍柱体积pH2.7洗脱缓冲液过柱，保持流速为4s/滴。

⑦平衡：用5-10柱体积的G柱偶联缓冲液平衡柱子回pH7.0，保持流速为4s/滴。

⑧保存柱子：pH7.0的柱子保存于4℃。长期不用的柱子，平衡后保存于20％乙醇中。

1.10单克隆抗体的抗体特异性鉴定

将本实验室构建的表达水貂IFN-γ的pCold-IFN-γ和pET32a-IFN-γ载体和表达pET32a-IFN-α的载体进行诱导表达，收集菌体，以31A，31B，31C，E44和G46单抗为一抗，山羊抗鼠IgG-HRP为二抗，用常规Westernblot方法检测和鉴定。取菌体样品进行处理并做SDS-PAGE，随后将电泳蛋白转移到NC膜上，200mA转印120min后；用5％的脱脂奶室温封闭过夜；PBST洗膜3次，5min/次，1:1000稀释制备的腹水，杂交瘤上清1:50倍稀释，室温孵育2h；PBST洗膜3次，5min/次，再与1:8000稀释的HRP-羊抗鼠IgG进行孵育，室温作用1h后洗膜3次，5min/次，然后用ECL显色进行分析。

1.11免疫荧光检测

设计一对特异性引物：

上游5′-GTGAATTCCAGGCCATGTTTTTTAAAGA-3′，引物酶切位点EcoRⅠ

下游5′-GACTCGAGGCAGGATGACCGTTATTTCG-3′，引入酶切位点XhoⅠ；

扩增IFN-γ全长基因，构建pcDNA3.1-MiIFN-γ真核表达质粒，转染Vero细胞，并以pcDNA3.1空质粒为转染对照，正常细胞为空白对照，48h后免疫荧光检测。用PBS洗未破碎的单层细胞3次；预冷的4％的多聚甲醛固定细胞30min，弃去上清，PBS洗涤3次，0.1％Triton-X-100室温通透10min，弃上清，PBS洗3次；稀释10倍的杂交瘤上清作用30min，洗孔3次，0.01％伊文思蓝PBS(含终浓度4％的羊血清)稀释兔抗鼠荧光标记IgG二抗1：1000室温作用1h，用PBS清洗3次，直接上荧光显微镜观察。

1.12杂交瘤细胞株的稳定性检测

将杂交瘤细胞株在体外连续培养，运用建立的间接ELISA方法及判定标准，取其中的F₅，F₁₀，F₂₀,F₃₀代次细胞上清和冻存4个月复苏后细胞培养上清测定其效价，检测其分泌抗体的能力。

2结果

2.1蛋白表达及纯化

水貂IFN-γ基因全长501bp，序列全长见图1，GenBank登陆号为KJ888148。预测前19个氨基酸为信号肽，成熟肽蛋白由167个氨基酸组成，目的序列含有3个半胱氨酸和3个潜在的N-糖基化位点。

2.2水貂IFN-γ可溶表达

将成熟肽基因构建至pColdⅡ，IPTG浓度1mM/L，30℃诱导10h，表达产物经过SDS-PAGE检测，表达产物为可溶性表达，表达结果见图2。

2.3间接ELISA筛选方法的建立及动物免疫水平效价检测

根据方阵实验的滴定，以检测的ELISAOD值约为1.0左右，且P/N比值最大的确定为抗原的包被浓度，因此，本实验最终确立的抗原稀释倍数为1:2560，浓度为0.15μg/ml，抗体稀释倍数为1:3000倍。

检测Balb/c免疫小鼠的血清效价，5次融合前检测小鼠血清具有较好的抗体效价，均达到5⁷以上。

2.4杂交瘤细胞株的获得

经细胞融合与ELISA筛选，两次筛选获得24株阳性杂交瘤细胞株，通过3次亚克隆后，将pCold-mFN-γ0.15μg/ml的重组蛋白包被96孔板，每孔100μl，以杂交瘤细胞为一抗，HRP标记的兔抗鼠IgG为二抗，ELISA检测24株单抗的亲和力，选出OD值大于1且稳定分泌抗mink-IFN-Y的五株杂交瘤细胞株，分别命名为31A、31B、31G、H44和F46株。

2.5单克隆抗体亚型的鉴定

按照单克隆抗体亚型鉴定试剂盒操作说明，对获得24株单克隆抗体进行了亚型鉴定。结果表明11株为IgG1型，9株为IgG2a型，2株为lgG2b型，其轻链均为为K链，实验结果见表1：

表1单克隆杭体亚型的鉴定

2.6水貂IFN-γ单克隆抗体结合活性与特异性

将表达水貂IFN-γ的pCold-IFN-γ和pET32a-IFN-γ和表达pET32a-IFN-α表达全菌蛋白转印到硝酸纤维膜上，分别以31A，31B，31G，H44和F46单抗为一抗，山羊抗鼠IgG-HRP为二抗，进行Western-blotting鉴定，加入100ulTMBECL显影，结果显示，5株单抗对pCold-IFN-γ和pET32a-IFN-γ反应均可见14kDa和20kDa的特异性反应条带，但对pET32a-IFN-α蛋白反应未见条带，表明这5株单抗均能特异性识别原核表达产物，且特异性好，结果见图3。

2.7免疫荧光检测

构建的pcDNA3.1/MIFN-γ质粒转染Vero细胞，同时做报告基因对照及正常细胞对照，应用筛选的5株单克隆抗体检测水貂干扰素表达，5株杂交瘤细胞株分泌的抗体中只有H44株使转染的细胞产生绿色荧光，而阴性血清对照和正常细胞对照没有绿色荧光。结果见图4。31A，31B和31G只能识别原核表达产物，而H44和F46既能识别原核表达产物，也能识别真核表达产物，可以用于天然水貂IFN-γ检测。而通过间接ELISA实验进一步发现，H44抗体效价更高，检测更敏感，可用于夹心ELISA检测方法的建立。

所得到的编号为H44的杂交瘤细胞株，命名为MiIFN-γ-H44(简称H44)，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其菌种保藏编号为：CGMCCNO.10953。

2.8杂交瘤细胞株的稳定性检测

通过建立的间接ELISA方法测定编号为H44的杂交瘤细胞F₅，F₁₀，F₂₀,F₃₀代培养上清和冻存4个月复苏后细胞培养上清，测其ELISA效价在1:10⁴-10⁵，说明该杂交瘤细胞能够稳定分泌抗体。

实施例2单克隆抗体的大量制备

1、单克隆抗体的大量制备

将稳定分泌单抗的H44号杂交瘤细胞株(MiIFN-γ-H44，CGMCCNo.10953)，通过扩大培养，接种于Balb/c小鼠腹腔内，使其以腹水瘤形式在小鼠腹腔内增殖，从而得到大量含单抗的腹水，具体操作如下：

1、杂交瘤细胞复苏与扩大培养

(1)6孔细胞培养板，每孔中加入细胞培养液约2ml。

(2)从液氮中取出细胞，放入37℃水浴锅中迅速解冻。

(3)吸取细胞放入5-10ml完全培养基，1000rpm离心5min，弃掉上清。

(4)将离心好的细胞上清液吸除，吸取1ml细胞培养液混匀沉淀细胞，将该细胞液吸出，混匀到相应的培养板孔中，放入细胞培养箱中进行孵育。

2、准备小鼠

根据将要进行的腹水项目数准备好相应数量小鼠。采用腹腔注射方式打石蜡油，一只Balb/c小鼠打石蜡油为500ul。

3、杂交瘤细胞收集与注射

(1)待细胞处于对数生长期，即可收集。吸取上清1ml后，吹打细胞，使其脱落，然后收集到15ml离心管中，1000rmp，5min离心。用适当的生理盐水重悬细胞沉淀，调整细胞浓度为5×10⁵—9×10⁵个/ml。(2)采用腹腔注射方式打腹水，每只鼠注射1ml。

4、腹水收集

(1)注射杂交瘤细胞后7天左右，小鼠腹腔开始鼓起较大时取腹水。

(2)左手把小鼠抓牢，右手拿针头(取腹水用针头)针头与小鼠平行。针从腹股沟和最靠下的两个乳头这三点形成的三角形中扎进去。针的一头放在备用离心管中。针扎进小鼠腹部不要太深，以免扎伤内脏。腹水就会顺着针管流进离心管里。取的过程中适当调换手的姿势，尽可能多取、快取。(最好两天取一次)

(3)取出的腹水5000转离心10min，离心后将腹水上清吸到相应离心管中，做好标记和记录。放到-20℃指定位置保存。

5、抗体纯化

(1)样本预处理：用相应的偶联缓冲液以1:3稀释，配平，10000rpm4℃离心20min，0.22μm滤膜过滤，除去脂肪、细胞残渣及小颗粒物质。(2)平衡：用5-10倍柱体积的相应偶联缓冲液平衡预装亲和柱，保持流速为4s/滴。(3)上样：用注射器把样品注入柱子上端接口，收集流出液于50ml离心管中，保持流速为5s/滴。洗杂：用5倍柱体积的偶联缓冲液过柱，保持流速为4s/滴。避免过度洗涤，如果目的蛋白和配体的相互作用很弱，过度洗涤会降低得率。(4)洗脱：用5倍柱体积洗脱缓冲液洗脱抗体，收集于上述EP管中。(5)再生：用5倍柱体积pH2.7洗脱缓冲液过柱，保持流速为4s/滴。(6)平衡：用5-10柱体积的G柱偶联缓冲液平衡柱子回pH7.0，保持流速为4s/滴。(7)保存柱子：pH7.0的柱子保存于4℃。长期不用的柱子，平衡后保存于20％乙醇中。纯化抗体浓度测定记录之后按要求分装、保存。取5ulSDS-PAGE凝胶检测，结果见图5。

实施例3ELISA方法的建立

1、水貂IFN-γ多克隆抗体的产生和效价测定

用重组的水貂IFN-γ蛋白免疫长耳兔，背部多点注射免疫三次，第一次免疫注射mIFN-γ30μg/只加弗氏完全佐剂佐剂，第二次及第三次免疫注射15μg/只加弗氏不完全佐剂，第一次和第二次，第二次和第三次免疫分别间隔2和4周，在三免后第10天采集耳缘静脉血测效价，无菌心脏采血收集血清。血清初始稀释度为1:100后倍比稀释，测得多克隆抗体ELISA滴度达到2×10¹²。

2、间接夹心ELISA方法的建立(单抗-抗原-多抗)

抗体包被量和血清稀释度的确定：

选取3个单克隆抗体(实施例2制备)包被浓度(1万、5万和10万倍)，及4个夹心抗体(兔抗IFN-γ多克隆抗体)浓度(1000、5000、1万和10万)，将MiIFN-γ稀释100、200、400、1000、2000、4000、10000和50000倍，进行夹心ELISA方阵滴定。以阳性对照OD值(P)≥0.4、阴性OD₄₅₀值≤0.2为有效测试。以OD₄₅₀值≥0.4时的最大稀释度为最佳稀释度。按滴定结果用包被液(25mmol/L碳酸盐缓冲液，pH9.6)适当稀释单克隆抗体，每孔100μL，置4℃包被过夜，按常规方法洗涤(洗涤液:5％Tween-20的PBS，pH7.4)与封闭(封闭液:0.2％BSA)。用保温液(含0.2％BSA、5％Tween-20的PBS，pH7.4)稀释抗原(重组MiIFN-γ纯化蛋白或病毒感染上清)，每孔100μL，置37℃1h，洗涤3次。加保温液适当稀释的兔抗MiIFN-γ多克隆抗体，每孔100μL，置37℃1h。洗涤3次，加封闭液稀释(1：5000)的HRP标记羊抗兔IgG，每孔100μL，置37℃30min，洗涤4次。每孔100μLTMB底物液室温避光反应10min，每孔加50μL2MH₂SO₄终止液，室温5min后读取450nm处的吸光值(OD₄₅₀nm)。

本发明利用单克隆抗体和高免血清2种抗体，对包被抗体和检测抗体的浓度进行选择，最终建立了单抗作为包被抗体，多抗作为检测抗体的双抗夹心ELISA方法。将纯化的单克隆抗体H44分别连续倍比稀释包被到96孔板的1～12列，100μl/孔；37℃孵育2h后，洗板3次，每次5min；加入5％的脱脂奶粉溶液，200μl/孔，37℃封闭1h，洗板同上；然后加入用待检样品，100μl/孔，37℃反应1h，洗板同上；加用PBST稀释至工作浓度的兔抗mIFN-γ血清，HRP标记的羊抗兔IgG为酶标二抗，然后加入100μl/孔的TMB显色液，50μl/孔2MH₂SO₄终止反应。

进行ELISA方阵滴定，结果证明，在所实验的三个包被抗体稀释度为10000，50000和100000中，最佳稀释度为10000倍；夹心抗体的4个稀释度1000，5000，10000以及和10万中，最佳稀释度为1000倍。在包被抗体10000倍稀释，浓度为0.0118μg/ml、夹心抗体1000倍稀释，浓度为0.126μg/ml条件下，可检测到0.1ug的水貂IFN-γ，100倍再稀释时，OD值仍能达到0.8。

1.13水貂IFN-γ的双抗体夹心ELISA的应用

选取检测犬瘟热病毒(CDV)、水貂肠炎细小病毒(MEV)及水貂阿留申病毒(ADV)为阴性的健康6月龄水貂，无菌分离水貂外周血淋巴细胞，具体方法参照实施例11.1节所述，调整细胞浓度至2.5×10⁵个/ml，用5ml1640培养基培养，用TCID₅₀分别为10^-5_.³的CDV野毒株(CDV-Hebei)和10^-5_.⁸的疫苗毒(CDV3)分别感染淋巴细胞，5ml淋巴细胞加入50μl病毒液，同时设感染阴性对照，分别在0h，3h，8h，24h，48h，72h，96h收集细胞上清待检。按照上述步骤中所述的检测方法检测。

用上述建立的夹心ELISA检测方法检测CDV3(GenBank登录号：EU726268)疫苗株和CDV-Hebei(GenBank登录号：KC427278)野毒株感染淋巴细胞后不同时间分泌的γ-干扰素水平。在0h、3h、8h、24h、48h、72h和96h不同时间点，淋巴细胞表达的γ-干扰素水平有差异，在起初的24h内，强毒CDV-Hebei株感染后γ-干扰素表达水平下降，在48小时上升到最高峰，72小时表达明显被抑制，而疫苗毒CDV3感染后，γ-干扰素变化趋势较强毒小(结果如图6所示)。

研究资料表明，T细胞产生IFN-γ是抗病毒防御效应机制之一，且很有可能是应答中最重要的功能，在病毒感染时CD8T细胞和CD4T细胞都能产生IFN-γ，而CD8T细胞是IFN-γ的主要生产者，大约60％-90％的T细胞表达IFN-γ，几乎所有其他表达IFN-γ的细胞是CD4T细胞。不同的病毒感染，CD8和CD4T细胞对IFN-γ应答的贡献大小可能根据特定病毒感染时各亚群应答的比例不同而变化(《FundamentalImmunology》，吴玉章译)。

综上所述，本发明建立了一种检测水貂IFN-γ夹心ELISA方法，应用该方法检测重要的免疫细胞——外周血淋巴细胞感染犬瘟热病毒后IFN-γ变化水平，其间接反应了机体的免疫状态。该方法灵敏、特异，可用于水貂病原感染外周血血清中细胞因子IFN-γ的检测，同样也可用于其他DNA或RNA病毒感染水貂细胞免疫应答水平的检测。