恶性疟原虫四环素诱导性转基因表达系统的构建与检测

摘要

该文拟建立一种抑制型疟疾四环素可诱导转基因表达系统,为研究可能在疟疾预防与治疗中有重要作用的新基因打下基础.但是目前已有的诱导性启动子在疟原虫中不具有功能性,而疟原虫本身又没有诱导性启动子.为构建一个在疟原虫对四环素或其类似物具有可诱导性反应的重组启动子,将7个拷贝的TetO(7-Copy ofTetO,7cot)插入到GBP130启动子单个转录起始位点(Transcriptional Initiation Site,TIS)附近.但由于在该TIS位点附近没有合适的限制性位点可用,首先利用重叠延伸PCR的方法在TIS上下游不同位点(即-5,-2,+2和+5)分别引入一个BamHI位点.以pTL-8为模板PCR扩增出7cot,然后利用其两端的BglⅡ与BamHI连接,分别构建4个反应载体,即pG/7T(-5),pG/7T(-2),pG/7T(+2)和pG/7T(+5).经PCR、限制性酶切和DNA测序分析表明构建完全正确.为鉴定7cot插入GBP130启动子后对启动子活性的影响,上述4个反应载体及其原始载体pGBPCAT△2分别用来电转环状体恶性疟原虫.CATELISA检测表明,4个反应载体中的CAT表达水平均高于pGBPCAT△2,并且7cot的定位越靠近下游CAT表达水平越高.说明7cot插入GBP130启动子后对启动子活性有促进作用,当7cot插入+5时启动子活性最高.因此,载体pG/7T(+5)可用于疟疾四环素可诱导转基因表达系统中的反应载体.为构建调节载体,PCR扩增TetR后克隆入质粒pD的单克隆位点BamHI,其表达由伯氏疟原虫的二氢叶酸还原酶-胸苷合成酶基因的5'和3'侧翼序列控制,构成载体pDT.反应载体和调节载体建成后,将pG/7T(+5)和pDT共转染疟原虫,以脱羟基四环素(Anhydrotetracycline,ATc)进行诱导,鉴定系统的诱导性.CAT检测表明,在ATc加入和不加入的转染组没有明显变化,即没有可调控性变化.为进一步提高报告基因的敏感性,以LUC置换pG/7T(+5)中的CAT,构成pGL(+5),然后与pDT再次进行共转染.诱导剂ATc的使用浓度分别为1μg/mL、0.5μg/mL和0.1μg/mL.LUC活性检测表明仍然没有发现可诱导性反应.推测可能是由于TetR的调控序列源于伯氏疟,在恶性疟中没有转录调控功能;或者是GBP130启动子不适合于恶性疟的四环素可诱导系统;或者是其他可能的但是没有发现的因素.具体原因则有待进一步研究.

目录

独创性声明及保护知识产权声明

缩略语表

前言

文献回顾

四环素可调控基因表达系统的研究进展

1工作原理

2基本组成

3发展改进

寄生原虫的Tet可诱导表达调控系统

1锥虫

2阿米巴

3利什曼

4弓形虫

5贾第虫

6阴道毛滴虫

研究内容

1材料

1.1菌株

1.2载体

1.3试剂

1.4 GBP130启动子序列

1.5引物

1.6原虫

1.7仪器

2方法

2.1在GBP130启动子中引入限制性位点

2.2 pUC/KBN系列载体的构建

2.3 pUC/7T系列载体的构建

2.4 pG/7T系列载体的构建

2.5调节载体pDT的构建

2.6pGL系列载体的构建

2.7红内期疟原虫体外连续培养

2.8疟原虫同步化处理

2.9质粒的大量提取和纯化

2.10红内期疟原虫的转染

2.11转染虫体细胞抽提物的制备

2.12 CAT活性的检测

2.13 Luciferase活性的检测

2.14 7cot的插入对GBP130启动子活性的影响

2.15脱羟基四环素虫体毒性分析

2.16瞬时转染系统诱导性的初步分析

3结果

3.1pUC/KBN系列载体的鉴定

3.2 pUC/7T系列载体的鉴定

3.3 pG/7T系列载体的鉴定

3.4 7cot的插入对启动子活性的影响

3.5调节载体pDT的鉴定

3.6以CAT为报告基因检测系统诱导性

3.7 pGL系列载体的鉴定

3.8疟原虫对ATc体外敏感性分析

3.9以LUC为报告基因检测系统诱导性

4讨论

4.1诱导性重组启动子的构建

4.2 TetO元件对启动子的影响

4.3报告基因的检测

4.4四环素及其类似物的选用

4.5系统诱导性

5小结

参考文献

个人简历

发表主要学术论著

其他相关工作

致谢