融合细胞因子影响HBV preS2S基因疫苗免疫效果的初步研究

摘要

该研究中我们选择HBV preS2+S基因片段作为DNA疫苗的靶抗原,应用分子克隆技术构建了pcDNA3.1S2S、pcDNA3.1S2S/IFNα、pcDNA3.lIL-2/Fc、pcDNA3S2S/Fc、pcDNA3IFN-α五种真核表达质粒,并在Vero-E6或SP2/0真核细胞中进行了瞬时表达;重组质粒经大量制备纯化后免疫BALB/c小鼠,通过检测各组小鼠免疫后的抗-HBs滴度、CTL的杀伤活性、培养脾细胞的增殖分析、培养脾细胞细胞因子的分泌水平以及脾细胞中CD25的表达量,比较分析了含IL-2/Fc的质粒作为基因型佐剂对HBV preS2S DNA疫苗诱发免疫反应的影响;并且分析比较了pcDNA3.1S2S/IFNα和pcDNA3S2S/Fc分别免疫后诱发的体液和细胞免疫反应.主要研究内容和结果如下:1.应用分子克隆技术,构建五种真核表达质粒pcDNA3.1S2S、pcDNA3.1S2S/IFN-α、pcDNA3.1IL-2/Fc、pcDNA3S2S/Fc、pcDNA3IFNα,经酶切和序列测定分析,确定目的片段的克隆和连接正确.2.通过脂质体介导,分别将它们转染入Vero-E6或SP2/0细胞中,经ELISA和间接免疫荧光法证实,可以在真核细胞中正确表达目的蛋白.3.采用布比卡因预处理,100μg/只/次的方法肌肉注射后肢股四头肌分组免疫BALB/c小鼠,分别检测诱导的体液和细胞免疫反应.4.pcDNA3.lIL-2/Fc免疫组在初次免疫后2周末即出现100％的抗-HBs抗体阳转率,CTL杀伤活性、淋巴细胞的增殖反应、Th1型细胞因子的分泌水平及脾细胞CD25的表达量都比对照组明显增强.5.为了确定抗原与佐剂的最佳应用方案,我们比较HBV DNA疫苗免疫后第3天注射佐剂pcDNA3.lIL-2/Fc或两者同时注射诱导体液和细胞免4疫效果,证明前者优于后者,后者诱导的免疫反应和HBV DNA疫苗单独应用时效果相当.6.我们同时进行了HBV preS2S与IFN-α融合表达的重组质粒pcDNA3.1S2S/IFNα的实验.通过检测体液和细胞免疫反应显示其诱导的免疫反应比单独应用IFN-α质粒作为佐剂及对照组明显增强.7.pcDNA3S2S/Fc免疫组诱导的免疫反应与单独应用HBV DNA疫苗时的效果相当.8.我们同时分析了抗原与细胞因子融合的形式pcDNA3.1S2S/I刚-α质粒和pcDNA3.lIL-2/Fc作为免疫佐剂组所诱导的免疫反应的结果,通过SPSS统计软件分析,其差异没有统计学意义.

目录

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缩略语表

前 言

文献回顾

一、乙型肝炎病毒的归属及结构

二、病毒基因组及编码蛋白

三、乙型肝炎病毒复制周期

四、乙型肝炎的慢性化机理

五、乙肝病毒感染的免疫

六、HBV目前的治疗概况

七、应对策略

八、DNA疫苗的基因佐剂

九、新型免疫调节剂：免疫球蛋白-细胞因子融合分子

第一部分融合细胞因子重组真核表达载体的构建及其在真核细胞中的瞬时表达

第一节含IL-2/Fc融合基因真核表达载体的构建及其在真核细胞中的瞬时表达

第二节含HBV PreS2S/Fc融合基因真核表达载体的构建及其在真核细胞中的瞬时表达

第三节含HBV preS2S/IFN-α融合基因真核表达载体的构建及其在真核细胞中的瞬时表达

1材料和方法

2结果

3讨论

参考文献

第二部分融合细胞因子的重组质粒对HBV preS2S DNA疫苗在小鼠体内免疫效果的影响

第一节重组真核表达质粒pcDNA3.1TL-2/Fc对HBV preS2S DNA免疫作用的影响

1材料与方法

2结果

3讨论

参考文献

第二节重组真核表达质粒pcDNA3.1S2S/IFNα对小鼠免疫反应的影响

全文小结

文献回顾部分参考文献

致谢

附录 个人简历和研究成果