细胞因子融合蛋白质粒及在体电脉冲技术增强治疗性HBV DNA疫苗免疫效果的研究

摘要

乙型肝炎病毒(HBV)感染患者自身抗HBV特异性细胞免疫状态是决定HBV感染自然史和转归的重要因素之一，探寻有效的免疫调节治疗手段来激活或增强慢性乙型肝炎(CHB)患者机体抗HBV特异性细胞免疫应答，以达到打破免疫耐受或提高现有抗病毒药疗效的目的，是目前慢性HBV感染防治领域研究热点，将成为今后抗病毒治疗策略调整的趋势。 本项研究以BALB／c小鼠、新西兰家兔、非人类灵长类动物猴及HBV转基因(Tg)小鼠为动物模型和研究对象，评价和探讨pFP及EP分别增强和提高治疗性HBVDNA疫苗免疫原性及质粒宿主细胞内转染率的辅助效果和机理。 第一章：双质粒HBVDNA疫苗及在体电脉冲仪(EP)的研制和检定 治疗性双质粒HBVDNA疫苗系采用基因重组技术构建的HBV包膜中蛋白(preS2+S)基因真核表达质粒(HBVDNA疫苗)联合佐剂质粒组成的双质粒治疗性DNA疫苗。在接种HBVDNA疫苗的同时，联合注射编码人白细胞介素融合蛋白(IL-2／IFN-γ)基因质粒作为佐剂，以辅助前者对机体免疫应答的诱导，使其激活的T细胞向Th1亚群分化，以期望更有效地诱导产生细胞免疫应答而打破因慢性HBV感染所导致的机体免疫耐受，达到清除病毒的治疗目的。 本研究中，将编码HBV胞膜中蛋白的基因序列插入真核表达载体pcDNA3.1构建了重组pS2.S质粒。为增强其免疫原性，我们构建了IL-2／IFN-γ融合蛋白佐剂质粒pFP，它是由IL-2信号肽序列，IL-2全基因序列，24bp连接序列(编码AGSGGGGS)以及IFN-γ的全基因序列顺序连接在pCR的钝端构成。分子模拟根据pFP基因编码的IL-2和IFN-γ融合蛋白的一级结构进行。pFP所表达的蛋白的空间构象及与天然IL-2和IFN-γ构象的比较通过数字分子模型软件来(NewProvidence，PA)完成。用脂质体转染试剂转染COS-7细胞，以ELISA，增强化学发光法(ECL)-Westernblotting检测转染细胞培养上清中目的基因表达，并分别以CTLL-2依赖细胞株／MTT比色法和微量细胞病变抑制法(WISH-VSV)检测pFP转染后不同时间点培养上清中IL-2及IFN-γ活性。 第二章：pFP增强DNA疫苗免疫原性的实验研究 观察佐剂质粒(pFP)以不同剂量和给药方式联合DNA疫苗(pS2·S)应用诱导机体体液免疫(血清抗-HBs水平)的效果，摸索出最适的免疫接种方法(包括免疫剂量、双质粒配伍和给药途径)，以提高DNA疫苗的体内免疫效果并为下一步确定细胞免疫实验中动物接种方式提供参考。 2.1pFP联合HBVDNA疫苗免疫诱导体液免疫结果 三个不同剂量的HBVDNA疫苗(pS2.S)单独免疫BALB／c小鼠后血清抗-HBs水平及阳性数观察结果，大(100μug/只)、中剂量组(50μg／只)初次免疫2周时分别为86.0±46.6mIU／ml，45.8±26.0mIU／ml并可诱导组内全部动物抗体水平呈阳性，而低剂量组(10μug／只)水平为16.2±9.3mIU／m，组内抗体阳性数仅为3只(每组5只)。4、8、14周时各组抗体水平均有升高，但高、中剂量组升高较低剂量组更为明显。 联合免疫效果显示，高、中剂量组2、4周时均能诱导组内全部动物抗体水平呈阳性，二组4周时抗体水平较低剂量组升高明显，差异具显著性(P<0.05)。 2.2pFP联合pS2.S诱导细胞免疫应答结果 pFP(50ug／只)联合pS2·S(50μg／只)免疫组小鼠脾细胞体外经HBsAg刺激培养上清IL-2／IFN-Y水平(263.5±52.0／38.4±11.9pg／ml)较同剂量的pS2·6联合空载体pcDNA3.1免疫组(149.6±22.2／10.1±4.3pg／ml)高，差异具显著性(P<0.01)；IL-4水平于各组质粒免疫影响不明显。 2.3不同细胞因子表达质粒联合pS2.S免疫诱导HBsAg-特异性免疫应答结果 结果显示，pmlL-2+pmIFN-γ[(2.5+2.5)μg／只]联合pS2.S免疫诱导HBsAg-特异性体液免疫和细胞免疫效果最佳，并与相同剂量的pS2·S+pFP组效果相当，主要表现为其组内诱导的特异性分泌IFN-γT细胞阳性反应动物数目与单独使用细胞因子质粒(pmlL-2或pmIFN-γ)及pmFP免疫组(未获得阳性应答)具本质性差别，提示IL-2及IFN-γ质粒作为免疫佐剂在增强HBVDNA疫苗免疫效果上具有协同效应。而鼠源性融合蛋白(pmFP)在本实验中未显示出佐剂效应，推测可能与其构建时所选用的连接肽基因(与人源性pFP相同)未能在融合蛋白分子结构上保持IL-2及IFN-γ各自活性有关。 第三章：在体电脉冲法提高HBVDNA疫苗免疫效果的实验研究 本研究以新西兰家兔、恒河猴及食蟹猴为实验对象，观察评价EP通过提高裸DNA质粒在宿主体内细胞导入率，增强HBVDNA疫苗诱导大体重动物特异性免疫应答效果。另采用高水力学注射法(hydrodynamicinjection或水力注射法)将质粒pS2.S转染至BALB／c小鼠肝细胞内作为模型，观察EP介导的pS2.S免疫对该模型小鼠肝细胞HBsAg表达的抑制效果。 3.1EP联合接种HBVDNA疫苗诱导兔和猴特异性免疫应答结果 整个实验整个观察过程，未经EP介导的高剂量[(1000+1000)μg/只]双质粒HBVDNA疫苗(pS2.S+pFP)免疫组内各只动物(家兔或猴)血清抗-HBs均为阴性水平(<10mIU／ml)。 3.2EP介导的HBVDNA疫苗免疫对小鼠肝内HBsAg表达水平的影响 观察肝组织病理及血清转氨酶(ALT)水平变化结果发现，动物经水力注射转染pS2.S后肝组织病理无明显改变，尽管血清ALT呈现短暂性升高，但各时间点上pS2.S+EP与对照组比较无显著性差异。 第四章：pFP联合EP提高治疗性HBVDNA疫苗效果的评价 本研究以健康BALB／c小鼠及HBV转基因(Tg)小鼠为研究对象，分别比较分析和系统研究pFP、EP单独和二者联合应用增强HBVDNA疫苗体液免疫及细胞免疫效果的辅助作用，探寻最佳的接种组合方式及给药剂量。在此基础上，进一步评价和探讨联合免疫增强HBVTg小鼠细胞免疫及促进病毒应答的治疗效果及初步作用机理。 4.1健康BALB／c小鼠免疫应答效果 研究结果表明，EP以提高HBVDNA疫苗体液免疫应答效果最为明显，其辅助作用较pFP强；而在本研究中仅pFP能显示出明显增强DNA疫苗诱导的细胞免疫效果的佐剂作用。因此，我们认为EP联合pFP在HBVDNA疫苗免疫(即A组：pS2.S+pFP+EP)能获得最佳的体液和细胞免疫应答效果。以上述组合方式接种不同剂量的HBVDNA疫苗，结果显示具有一定的剂量依赖性，为进一步的HBVTg动物模型实验有效剂量的选择奠定了实验基础。 4.2HBVTg小鼠模型实验结果 本研究结果表明，pFP能够显著增强EP介导的HBVDNA疫苗免疫HBVTg的治疗效果，表现为pFP联合免疫能持续性抑制HBVDNA的复制及表达。EP的引用大大降低了质粒的有效接种剂量。观察终点(12周)时，pFP联合HBVDNA疫苗免疫组Tg小鼠血清HBVDNA水平显著低于DNA疫苗单独免疫及对照组，个体血清HBVDNA及肝组织HBsAg表达水平降低的同时，伴随其血清ALT水平及HBsAg特异性IFN-γ分泌细胞数目的升高。值得注意的是，DNA疫苗免疫组肝脏细胞空泡样变较对照组明显，可能与DNA疫苗免疫所介导的HBV特异性或非特异性免疫应答造成的肝脏炎症损伤有关。由于小鼠动物模型基础上研究外周血单个核细胞(PBMC)免疫应答水平的局限，本文结果中病原学与免疫学应答相关性的研究仅限于观察结束的一个时间点上，但所要提示的与近年来文献报道结论基本一致，即HBV的清除与溶细胞或非溶细胞性免疫应答有关。 综上所述，Th1型细胞因子IL-2／IFN-γ融合蛋白编码基因质粒(pFP)联合HBVDNA疫苗(pS2.S)接种能有效增强pS2.S的免疫效果，pFP与pS2.S剂量按1:1配伍混合共注射免疫效果最佳；在体电脉冲(EP)技术通过提高质粒DNA体内细胞转染率，有效增强HBVDNA疫苗在各种动物(包括非人类灵长动物)诱导的免疫效果；pFP通过加强初始T细胞向Th1方向分化，能够增强HBVDNA疫苗免疫的治疗性作用，与EP联合HBVDNA疫苗治疗HBVTg小鼠后，能在一定程度上抑制Tg小鼠HBVDNA复制和HBsAg表达。 以上研究结果有益于目前DNA疫苗及裸质粒基因治疗技术瓶颈性难题的解决，并为寻找更有效的抗HBV感染免疫治疗策略提供新的技术途径和实验依据。

目录

文摘

英文文摘

声明

绪论

第一章 双质粒HBV DNA疫苗及在体电脉冲仪(EP)的研制和检定

1材料与方法

2结果

3讨论

4参考文献

第二章 pFP增强DNA疫苗免疫原性的实验研究

1材料与方法

2结果

3讨论

4参考文献

第三章 在体电脉冲法提高HBV DNA疫苗免疫效果的实验研究

1材料与方法

2结果

3讨论

4参考文献

第四章 pFP联合EP提高治疗性HBV DNA疫苗效果的评价

1材料与方法

2结果

3讨论

4参考文献

全文讨论与总结

在校期间发表的论文

致谢