诱导烟草双抗同源植物病毒dsRNA的研究

摘要

马铃薯Y病毒(PVY)、马铃薯X病毒(PVX)和马铃薯卷叶病毒(PLRV)引起的病害是造成我国马铃薯退化、烟草产量损失的主要原因，严重危害我国的马铃薯和烟草的生产。PVY、PVX、PLRV混合侵染带来的损失远远大于各病毒单独侵染。RNA介导的病毒抗性(RMVR)是近年发展起来的一种新的植物抗病毒基因工程策略，具有抗病性强、抗性持久、生物安全性高等特点。利用该策略进行植物病毒防治具有广阔的应用前景和重要的实践意义。
　　 本研究拟以生产上为害较重的植物病毒PVY、PVX、PLRV的CP基因为基础，以L4440为载体构建含有植物病毒(PVY、PVX、PLRV)CP基因左、中、右片段的两两组合的9个原核表达反向重复载体;通过大肠杆菌RNaseⅢ缺陷型菌株HT115进行dsRNA的大量表达，并对产生的dsRNA进行了诱导抗病毒试验，探索外生多抗植物病毒dsRNA诱导寄主植物抗病毒的效果，以为外生dsRNA的实践应用奠定基础。主要结果如下:
　　 1.以PLRV、PVX、PVY的全长CP基因，获得了PLRV、PVY、PVY的左、中、右三段CP基因片段，并以此为基础，构建了分别含有PLRV左、中、右端CP基因片段和PVX左、中、右端CP基因片段的反向重复的原核表达载体L4440RX1、L4440RXm、L4440RXr;含有PLRV左、中、右端CP基因和PVY左、中、右端CP基因的反向重复的原核表达载体L4440RY1、L4440RYm、L4440RYr;舍有PVX左、中、右端CP基因和PVY左、中、右端CP基因的反向重复的原核表达载体L4440XY1、L4440XYm、L4440XYr。
　　 2.将其分别转化大肠杆菌菌株HT115，获得了相应的转化体HTRX1、HTRXm、HTRXr、HTRY1、HTRYm、HTRYr、HTXY1、HTXYm、HTXYr，这些菌株分别经过IPTG诱导表达，获得了相应的dsRNA。
　　 3.以菌株HTRY1为例，进行了dsRNA原核表达条件的研究。绘制了菌株HTRY1的生长曲线，研究了IPTG浓度和诱导时间对该菌株dsRNA表达量的影响。发现最终确定了IPTG诱导表达条件为:新接种菌株摇菌3.5h，菌体浓度OD600可达到0.6，此时加入0.3-0.4mmol/LIPTG，诱导表达4-5h，可得到最大量的dsRNA。
　　 4.用菌株HTXY1、HTXYm、HTXYr所获得的dsRNAxyl、dsRNAxym、dsRNAxyr提取液10×、50×、100×倍稀释物处理烟草，并同时进行相应病毒的攻毒的试验，间接ELISA结果显示，所提的dsRNA均具有诱导烟草兼抗PVY和PVX的能力，它能诱导烟草延缓其同源病毒的发生和为害。
　　 上述结果证实利用转录后基因沉默机制，通过构建含有不同植物病毒部分植物病毒基因片段用于生产dsRNA的原核表达载体，在特定的细菌菌株中诱导表达相应的dsRNA，可用于其同源病毒的防治，它们能够诱导植物产生病毒的抗性，这为植物抗病毒的综合防治策略的制定奠定了基础，植物病毒源的多抗dsRNA在植物病毒病的防治上具有广阔应用前景和实践意义。

目录

摘要

重要缩写词及中英文对照

第一章 前言

1．1 植物病毒病的危害与防治

1．1．1 植物病毒病的危害

1．1．2 现阶段植物病毒的防治策略

1．2 RNA介导的植物抗病毒基因工程

1．2．1 转录后基因沉默

1．2．2 转录后基因沉默的诱导

1．2．3 转录后基因沉默的机制

1．2．4 转录后基因沉默在植物抗病毒中的应用

1．3 本研究的目的及意义

第二章 dsRNA原核表达载体的构建

2．1 材料与方法

2．1．1 植物病毒毒源

2．1．2 菌株、质粒和主要试剂

2．2 方法

2．2．1 目的片段的获得

2．2．2 本研究PCR反应体系及反应条件

2．2．3 目的DNA片段的回收

2．2．4 质粒DNA的提取

2．2．5 DNA浓度的测定

2．2．6 目的DNA的酶切

2．2．7 质粒DNA与目的DNA片段PLRV-PVX的连接

2．2．8 感受态细胞的制备

2．2．9 质粒DNA向大肠杆菌中的转化

2．2．10 重组质粒的鉴定

2．3 结果与分析

2．3．1 目的基因片段的获得

2．3．2 重组质粒L4440RXl、L4440RXm、L4440RXr的构建

2．3．3 重组质粒L4440RYl、L4440RYm、L4440RYr的构建

2．3．4 重组质粒L4440XYl、L4440XYm、L4440XYr的构建

2．4 结论与讨论

第三章 dsRNA的原核表达的条件研究

3．1 材料和方法

3．1．1 材料

3．1．2 方法

3．2 结果分析

3．2．1 dsRNA的诱导与提取

3．2．2 菌体的生长曲线

3．2．3 IPTG浓度对dsRNA诱导表达产量的影响

3．2．4 IPTG不同诱导时间对dsRNA表达量的影响

3．3 讨论

第四章 烟草攻毒试验

4．1 材料与方法

4．1．1 材料

4．1．2 方法

4．2 结果与分析

4．2．1 dsRNA的诱导与提取

4．2．2 dsRNA诱导烟草对PVY的抗性检测

4．2．3 dsRNA诱导烟草对PVX的抗性检测

4．3 讨论

第五章 总结与展望

参考文献

附录 常用缓冲液及培养基配方

致谢

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