RhoA亚家族分子对胃癌细胞增殖与侵袭的影响

摘要

胃癌是人类最常见的恶性肿瘤之一，越来越多的证据表明胃癌的发生、发展是多种因素包括癌基因的激活、抑癌基因的失活、DNA损伤修复机制的破坏等共同作用的结果。目前对于胃癌的治疗效果仍不十分理想，其中浸润转移的程度是影响其预后的主要因素。Rho蛋白几乎参与了所有的细胞基础性生命活动过程，并发挥着重要作用。越来越多的研究发现Rho家族成员在多种肿瘤组织表达异常，并和肿瘤恶性程度相关，提示其在肿瘤发生、发展中发挥了重要作用。RhoA、RhoB、RhoC是Rho家族的主要成员，又称为RhoA亚家族。近年来，RhoA亚家族分子在肿瘤转移中的作用倍受关注，本实验室前期的研究也显示RhoC在胃癌转移灶的表达明显高于原发灶，为进一步研究RhoA亚家族在胃癌转移中的作用，本实验利用RhoA的显性突变体V14RhoA和野生型RhoB与RhoC研究对其胃癌细胞的恶性生物学行为的影响，并利用小干扰RNA技术观察抑制RhoC表达对胃癌细胞迁移、侵袭的作用。本研究为RhoA亚家族分子可能成为新的逆转胃癌转移的靶分子提供了实验基础，为胃癌的靶向治疗提供了一定的理论依据。 目的：(1)利用正义基因转染技术分别建立RhoA、RhoB和RhoC表达上调的胃癌SGC7901细胞系，并检测对转染细胞株的生物学行为的影响。(2)利用siRNA技术建立RhoC显著下调表达的胃癌SGC7901细胞系，并观察RhoC表达下调对胃癌细胞恶性生物学的影响及探讨其可能的分子机制。 方法：第一部分：(1)脂质体介导法分别将编码正显性RhoA突变体(V14RhoA)与野生型RhoB(wt-RhoB)和RhoC(wt-RhoC)的真核表达载体转染入胃癌SGC7901细胞中；筛选出稳定抗性克隆；(2)Westernblot鉴定转染结果；(3)用CCK-8(CellCountingKit-8，细胞计数试剂盒-8)检测转染细胞株的生长速度，并绘制生长曲线；(4)流式细胞仪(FCM)检测转染细胞株及其对照细胞的细胞周期分布；(5)MTT法检测转染细胞株及其对照细胞对化疗药物敏感性的差异；(6)损伤刮擦实验检测转染细胞株体外迁移能力的改变。 第二部分：(1)在计算机辅助下利用VectorNTI软件设计并构建RhoC的小干扰RNA(siRNA)真核表达载体；利用脂质体介导法将一组RhoCsiRNA分别转染胃癌SGC7901细胞；筛选出稳定抗性克隆；(2)Westernblot检测RhoCsiRNA转染后的抑制效应，并选出最能抑制RhoC表达的细胞；(3)用CCK-8检测RhoCsiRNA转染细胞株的生长速度，并绘制生长曲线；(4)MTT法检测转染细胞株及其对照细胞对化疗药物敏感性的差异；(5)损伤刮擦实验和TRANSWELL小室实验分别检测转染细胞株载体外迁移与侵袭能力的改变；(6)软琼脂克隆形成实验观察转染细胞及其对照细胞非锚定依赖性生长的能力；(7)DNAmicroarray观察下调RhoC蛋白表达对基因组的影响。 结果：第一部分：(1)Westernblot鉴定结果显示成功地将V14RhoA、wt-RhoB与wt-RhoC转染入胃癌SGC7901细胞；(2)生长速度检测显示RhoA活性增强可促进胃癌细胞的增殖；上调RhoB表达抑制胃癌细胞的增殖；上调表达RhoC则对胃癌细胞的增殖无明显影响；(3)细胞周期结果显示RhoA活性增强时进入S期的细胞比例与对照及其它两种转染细胞相比显著增大；上调RhoB表达则进入S期的细胞比例与对照及其它两种转染细胞相比明显减小；而上调RhoC表达的细胞与对照细胞相比S期比例无明显差别；(4)体外药物敏感试验结果显示RhoA活性增强可降低胃癌细胞对化疗药物的敏感性；上调RhoB表达可增强胃癌细胞对化疗药物的敏感性；上调RhoC表达对化疗药物的敏感性无明显的影响；(5)损伤刮擦实验显示上调表达RhoC可促进胃癌细胞的迁移。 第二部分：(1)成功构建RhoCsiRNA的真核表达载体，并经酶切及测序鉴定证实；(2)筛选得到稳定抗性克隆；经Westernblot鉴定得到最能抑制RhoC蛋白表达的细胞株；(3)生长速度检测显示下调RhoC蛋白的表达对细胞的生长速度无明显影响；(4)体外药敏试验结果显示下调RhoC蛋白的表达对细胞的对化疗药物的敏感性无明显影响；(5)损伤刮擦实验和TRANSWELL小室实验结果显示下调RhoC蛋白的表达抑制细胞的迁移与侵袭；(6)软琼脂克隆形成实验结果显示下调RhoC蛋白的表达不影响细胞非锚定依赖性生长的能力；(7)DNAmicroarray分析结果：发现一系列差异表达的基因，下调基因总数411，上调基因总数178。其中差异明显的基因有：CCND3，IGFBP1，IGFBP6，IGFBP7，SIPA1，TM4SF7，DUSP6，TP53，MCAM，WISP2，NFKB2，TRIM28，PDE4D，ITPR1，RAB7L1，RRAS(表达下调)；PDGFRL，MED8，CLIC4(表达上调)。 结论：(1)增强RhoA活性可促进胃癌细胞的增殖，但降低胃癌细胞对化疗药物的敏感性；(2)上调RhoB表达可抑制胃癌细胞的增殖，却增强胃癌细胞对化疗药物的敏感性；(3)上调RhoC的表达对胃癌细胞的增殖及对化疗药物的敏感性均无明显影响，却可以促进胃癌的迁移；下调RhoC的表达可抑制胃癌细胞的迁移与侵袭；

目录

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缩略语表

前言

文献回顾 Rho家族与胃癌的研究现状与分析

第一部分RhoA亚家族分子表达上调与胃癌细胞恶性表型的关系

第二部分RhoC表达下调对于胃癌细胞迁移和侵袭的影响

小 结

参考文献

个人简历和研究成果

致 谢