基于60Co诱变的槐耳新品种选育

摘要

槐耳(Trametes robiniophila Murr)是一种珍稀食用菌，槐耳的主要成分是蛋白多糖。槐耳蛋白多糖具有广谱抗癌作用，槐耳蛋白多糖能够激活巨噬细胞，增强巨噬细胞的吞噬功能，诱导产生干扰素，促进NK细胞活性，提高细胞免疫和体液免疫功能。因此，槐耳高产多糖新品种培育成为槐耳生产和科研中的一个重要课题。60Co辐射诱变是选育食用菌新品种的重要手段，具有方便、快捷等一系列优点。本课题采用槐耳T作为诱变材料，进行60Co射线的诱变（剂量设置为:1000 Gy，剂量率为:10Gy/min），筛选多糖含量高适合栽培的新菌株。 通过细胞悬液涂布的方法分离获得单菌落1125株，1125个挑取的单菌落和出发菌株T拮抗试验进行初筛，得到8株突变候选菌株，分别是:T6、T189、T278、T367、T611、T764、T825、T1120。采用两两拮抗试验发现8个突变候选菌株间都产生明显的拮抗线。说明8个突变候选菌株是不同的菌株。对8株突变株通过苯酚硫酸法测定多糖含量发现T189的多糖含量最高，为37.13％比槐耳T(27.48％)提高35.1％。初步判定为选育的新菌株。 采用菌丝生长速度测定、液体菌丝量测定、菌落形态比较的方法对T和T189进行生物学鉴定，得到T189的生长速度为7.3 mm/d，而槐耳T的生长速度为6.4 mm/d，比T生长速度快0.9mm/d;槐耳T189的菌丝生物量为0.27 g/100ml，T的菌丝生物量为0.22 g/100ml，比槐耳T的高22.72％;显微观察菌丝发现T189出现的锁状联合要多于槐耳T，通过ERIC-PCR鉴定发现T189与出发菌株T遗传物质有一定差异，相异系数达到0.5。 通过单因素试验和四因素三水平正交试验方法筛选T189的最佳固体培养基配方。得到突变株T189的最佳碳源是麦芽糖，生长速度达到7.4 mm/d;最佳氮源是牛肉膏，生长速度达到5.7 mm/d;四因素三水平的正交试验选出突变株T189的最佳固体培养基配方为2％麦芽糖，0.8％牛肉膏，3％ KH2PO4，1％ MgSO4·7H2O。在此配方上T189的生长速度达到7.8 mm/d。 通过栽培试验对T189与T的产量和生物转化率进行比较，试验证明T189的生物转化率为73.9％，T的生物转化率为65.7％，T189比T提高12.5％，并且槐耳T189菇体较大，商品性状较好。 采用水提醇沉法提取槐耳子实体粗多糖，发现T189的粗多糖含量为2.87％，而T的粗多糖含量为2.57％，T189的粗多糖含量比T提高11.7％;槐耳粗多糖经过透析脱蛋白脱色处理后，得到槐耳纯多糖，槐耳T189的纯多糖得率为0.50％，T的纯多糖得率为0.47％，T189的纯多糖得率比T提高6.4％;槐耳T189和T的纯度相差不大分别是98.53％和98.64％。

目录

声明

摘要

文献综述

1 综述前言

1．1 槐耳的生物学特性

2 食用菌育种方法的研究进展

2．1 野生食用菌的驯化育种

2．2 孢子分离育种

2．3 食用菌杂交育种

2．4 食用菌诱变育种

2．5 细胞融合育种

2．6 转基因育种

2．7 小结

3 60Co辐射诱变育种应用进展

3．1 谷物

3．2 蔬菜

3．3 食用菌

3．4 小结

4 食用茵多糖的药用价值

5 槐耳菌质多糖的功效与研究现状

6 微生物鉴定方法

6．1 生物学鉴定方法

6．2 生化鉴定方法

6．3 分子生物学鉴定方法

6．4 小结

7 本研究的目的与意义

8 研究的主要内容

9 技术路线

第一章 槐耳突变株的筛选

1 试验材料

1．1 槐耳出发菌种

1．2 主要药品

1．3 主要器材

1．4 供试培养基

2 试验方法

2．1 出发菌株的活化

2．2 60Co辐射诱变

2．3 单菌落的获得

2．4 初筛突变候选菌株的获得

2．5 复筛突变菌株的获得

3 结果分析

3．1 单菌落

3．2 初筛结果

3．3 复筛结果

第二章 槐耳出发菌株与突变株的鉴定

1 试验材料

1．1 供试菌株

1．2 主要药品

1．3 主要仪器

1．4 供试培养基

2 试验方法

2．1 槐耳T与突变株T189生长、形态鉴定

2．2 槐耳T与突变株T189 ERIC-PCR鉴定

3 结果分析

3．1 槐耳T与突变株T189生长、形态鉴定

3．2 EZUP柱式真菌及基因组DNA抽提试剂盒法提取DNA检测

3．3 CTAB法提取DNA检测

3．4 ERIC-PCR产物结果

4 聚类分析图谱

第三章 槐耳突变株T189固体培养基配方的优化

1 试验材料

1．1 供试菌株

1．2 主要药品

1．3 主要仪器

1．4 供试培养基

2 试验方法

2．1 碳源试验

2．2 氮源试验

2．3 正交试验

3 结果分析

3．1 碳源试验结果

3．2 氮源试验结果

3．3 正交试验结果

第四章 槐耳T和T189的栽培试验比较

1 试验材料

1．1 试验菌株

1．2 主要药品

1．3 主要器材

1．4 试验配方

2 试验方法

2．1 槐耳一级种的制备

2．2 槐耳二级种的制备

2．3 槐耳栽培种的制备

2．4 槐耳菌袋制备

2．5 栽培料灭菌

2．6 接种

2．7 发菌

2．8 菌丝后熟

2．9 畦栽覆膜栽培

3．0 出菇管理及采收

4 结果分析

4．1 槐耳T和T189生物转化率的比较

第五章 T和T189子实体多糖的提取和纯化

1 试验材料

1．1 试验槐耳子实体

1．2 主要药品

1．3 主要器材

2 实验方法

2．1 槐耳子实体的处理

2．2 水提醇沉法提取粗多糖

2．3 Sevage法脱蛋白

2．4 粗多糖溶液透析

2．5 多糖溶液脱色

2．6 纯多糖的获得

3 结果分析

3．1 粗多糖含量的测定

3．2 槐耳T和T189纯多糖提取率及纯度测定

结论

展望

参考文献

在读期间科研学术成果

导师组意见

致谢