Notch信号途径在宫颈癌肿瘤发生中的作用及其机制的初步研究

摘要

宫颈癌是常见的妇科肿瘤之一，特别是在发展中国家更多见。近年来，其发病率和死亡率有所上升。感染高危型人乳头状瘤病毒(HPV)是本病发生过程中重要的危险因子，但这一关键因素在宫颈癌肿瘤发生中的作用机制尚未阐明。 从果蝇到人类，Notch途径的遗传特征高度保守；而在哺乳动物中，其构成尤为复杂。相邻的细胞配体与受体相互作用导致Notch蛋白连续裂解，释放出受体的胞内段(ICN)。ICN转入细胞核内，使得CBF1/Su(H)/LAG1(CSL)转录因子从一个抑制物转变为转录激活子。该信号途径参与细胞的分化、增殖和凋亡，并影响许多器官的发育和功能。 Notch途径的病理生理改变与肿瘤的发生相关。既往的研究表明，Notch受体和配体在正常的宫颈组织中有表达；并且在宫颈病变时，其表达有变化。因此，该信号途径在正常宫颈的组织发生及其肿瘤生成的过程中发挥着关键作用。Notch途径与宫颈癌的关系是一个新的研究领域。 有待于此，本实验拟研究Notch途径在宫颈癌肿瘤发生中的作用及其机制。目前，得到的主要结果如下： 1.用半定量RT-PCR检测30例宫颈癌组织及30例正常宫颈组织中Notch1mRNA的表达，结果显示两组的表达有差别，宫颈癌组织中的含量高。 提取各种宫颈病变细胞中的mRNA，并用RT-PCR检测；其中的部分细胞检测Notch1蛋白的表达。这些细胞包括含有HPV16DNA的SiHa、Caski和S12，以及含有HPV18DNA的HeLa；W12细胞含有游离型的HPV16DNA；而C33a不含HPVDNA。结果显示，本实验检测的整合有HPVDNA的细胞表达Notch1mRNA及其蛋白的水平较高。整合HPV16DNA的S12细胞表达高水平的Notch1蛋白；而无整合的W12细胞，其表达量低或无表达。这说明内源性Notch1蛋白的表达水平与病毒DNA的整合相关。 本实验研究Notch1蛋白在正常宫颈、宫颈上皮内瘤样病变到宫颈癌组织中的表达和在细胞内定位的变化。在30例正常宫颈组织中有22例未见到Notch1阳性染色；Notch1在30例CINⅠ-Ⅱ的表达仅为9例；在30例CINⅢ的表达为23例，主要定位于细胞浆及胞膜；在宫颈癌组织中的表达率为100％，多定位于细胞核中。Notch1的表达上调在宫颈癌肿瘤发生的过程中可能发挥着重要的作用。 2.为研究Notch途径在宫颈癌细胞中的作用机制，构建并鉴定一种检测细胞内活化的Notch信号的报告基因质粒pTP1-EGFP-N1；测序及鉴定后，与Notch1的胞内段(ICN)共转染宫颈癌细胞后有阳性表达。 3.本实验研究了宫颈癌的发生与Notch信号调控相关蛋白HPC2基因的关系。以宫颈癌组织和HeLa细胞基因组DNA为模板用PCR法扩增人HPC2基因片段，将此基因片段插入pGEM-Teasy载体，酶切鉴定并测序。Blast分析发现其C端一段保守序列具有多态性。该位点的改变可能与宫颈癌的发生有关。为进一步研究该基因在宫颈癌发生中的作用，构建了HPC2原核表达载体及真核表达载体。 4.利用脂质体，分别将含有Notch1(ICN)的质粒pRAMIC及对照质粒pEGFP-N1转染入HeLa等宫颈癌细胞。结果显示两组均发出绿色荧光，且转染后的细胞大小及外形无明显变化；并进一步比较了转染后Notch1的表达。稳定表达ICN及EGFP的细胞用G418筛选，分别构建了HeLa-ICN/EGFP(HeLa-ICN)和HeLa-EGFP细胞。 5.本实验研究了过表达Notch1(ICN)的宫颈癌细胞在细胞生长、增殖、凋亡及黏附力等方面的改变及其分子机制。细胞的生长增殖用MTT、胸腺嘧啶脱氧核苷渗入法和克隆形成实验检测；流式细胞仪分析细胞周期及凋亡的情况；细胞凋亡还用荧光显微镜观察计数；Westernblot分析相关蛋白的表达。结果显示，过表达Notch1(ICN)可抑制宫颈癌细胞的生长；瞬时转染Notch1(ICN)的HeLa细胞，其G1期的比率增加；细胞周期相关蛋白CyclinA、CyclinE和pRb的表达下降；p53和p21蛋白在稳定表达的HeLa-ICN细胞中表达上调，而在HeLa-EGFP细胞中未检出。同时，抑制凋亡的BCL-2蛋白在HeLa-ICN细胞中亦未检出。虽然Notch1途径可能参与了宫颈癌的肿瘤发生，但外源性过表达Notch1(ICN)通过阻滞细胞周期和诱发细胞凋亡，抑制了宫颈癌细胞的生长增殖。另外，同质性黏附率细胞计数亦减少。 6.本实验用Northernblot和转录活性实验检测Notch1(ICN)的过表达与HPVE6/E7的关系。结果显示：Notch1(ICN)的过表达显著地抑制了HPV阳性的宫颈癌细胞HeLa和SiHa的生长；过表达Notch1(ICN)通过c-fos的表达下调使得AP-1的活性受到抑制，进而导致E6/E7的转录下调，并对抗HPV诱导的细胞转化。 本实验结果显示，Notch途径的失调可能是宫颈癌肿瘤发生的机制之一。据此，我们提出一套宫颈癌发生机制的假说，描述了包括Notch异常表达在内的分子改变，为肿瘤的基因治疗提供思路。

目录

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缩略语表

前 言

文献回顾

第一部分 Notch1在宫颈癌组织和细胞中的表达

第二部分 Notch途径调控相关蛋白HPC2与宫颈癌的关系

第三部分 外源性Notch1对宫颈癌细胞的生物学效应

第四部分 过表达Notch1对HPV E6/E7作用及其机制

小 结

参考文献

附录

个人简历及研究成果

致谢