具有不同转位肽段的重组Immuno-tBid分子的基因构建、表达及对HER2阳性肿瘤细胞的杀伤作用

摘要

PE(PseudomonasexotoxinA)是绿脓杆菌分泌的单链毒素，由613个氨基酸组成，分为三个主要的结构域：结构域Ⅰa(1-252aa)的作用是识别并结合靶细胞；结构域Ⅱ(253-364aa)具有内吞体转位活性；结构域Ⅲ(400-613aa)催化延长因子EF-2ADP-核糖基化而使其失活。此外，还存在一个小结构域Ⅰb(365-399aa)，它的功能尚未明确。 用抗体取代PE结构域Ⅰa形成免疫毒素(Immunotoxin)，被用于肿瘤等的生物治疗。我们课题组在以往免疫毒素研究的基础上，将结构域Ⅲ替换为各种促凋亡分子如caspase-3、caspase-6、GrB等，构建了一种新型的肿瘤杀伤效应分子。PE结构域Ⅱ的作用是使裂解后的毒素部分或其他效应分子从内吞体转位到细胞质。但是关于PE转位结构域的有效长度各文献报导不一致，截短转位结构域，找到最小且又不丧失转位功能的转位功能区，可以降低整个融合蛋白的分子量，应用于人体时可以降低其免疫原性，从而更好地发挥其作用。 Bid(BH3-interactingdeathagonist)是Bcl-2家族BH3亚家族的一个成员，具有促凋亡活性。Bid蛋白只含BH3结构域，全长为195aa，分子量22KDa。Bid位于细胞浆，当其被活化的Caspase-8或其他蛋白酶切割后，去除其N末端片段，产生的截短体片断(truncatedBid，tBid；15kDa)从细胞浆转位到线粒体，主要通过控制细胞色素c(Cytc)和其它促凋亡分子的释放来调节细胞凋亡。 本文构建了含有三种不同转位肽编码区：1)PE(273-282aa)；2)DT(187-196aa)；3)9聚精氨酸的重组Immuno-tbid基因，即将不同转位肽基因的5′端和3′端分别与针对HER2单链抗体基因和活性型的tbid基因相连，分别命名为e23sFv-fPEBid，e23sFv-fDTBid和e23sFv-9RBid，与PE转位结构域为253-364aa的Immuno-tBid即e23sFv-PE(253-364aa)-tbid61分子进行比较。将上述基因瞬时转染HER2阳性肿瘤细胞人乳腺癌SKBr-3细胞和人胃癌SGC7901细胞，转染48h后间接免疫荧光染色观察细胞生长情况。结果显示转染细胞中Immuno-tBid呈分泌型表达，同时也观察到转染了e23sFv-fPEBid，e23sFv-fDTBid，e23sFv-9RBid组和e23sFv-PE(253-364aa)-tbid61组的细胞生长状态较差，出现了核固缩、核碎裂等凋亡特征，进一步行Cytc和AIF的染色，看到Cytc和AIF均释放入胞浆，MTT实验和细胞计数证实了转染的目的基因对肿瘤细胞生长的抑制作用。 将e23sFv-fPEBid，e23sFv-fDTBid，e23sFv-9RBid和e23sFv-PE(253-364aa)-tbid61基因稳定转染Jurkat细胞和CHO细胞，G418筛选获得阳性克隆，RT-PCR检测目的基因在mRNA水平的表达，取其培养上清进行Western-blot检测证实Immuno-tBid蛋白通过分泌途径产生。MTT实验绘制细胞生长曲线说明稳定转染的Jurkat细胞和CHO细胞能长期存活其本身不受影响。细胞上清共培养实验结果表明，转染细胞分泌的各种Immuno-tBid蛋白可特异性识别HER2阳性肿瘤细胞，而对HER2阴性的肿瘤细胞则没有杀伤作用。用细胞计数的方法比较几种具有不同转位肽的Immuno-tBid分子的杀伤作用，可以看出含有DT转位肽的Immuno-tBid分子的杀伤作用较强。 综上所述，具有不同转位肽编码区的Immuno-tbid基因导入培养细胞后，细胞所分泌的效应蛋白能够特异性识别、内化进入HER2阳性的肿瘤细胞，并在肿瘤细胞中裂解活化，释放出具有促凋亡活性的tBid蛋白，从而高效、特异地杀伤HER2阳性的肿瘤细胞。Immuno-tBid蛋白由单链抗体和人自身蛋白构成，并且由于我们对其转位功能区的截短，使其可能有的免疫原性降低。本研究为其临床应用提供了理论依据。

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