人类补体调节因子壳聚糖纳米微囊混合物体外及体内的初步实验研究

摘要

肝病是目前威胁人类健康的主要疾病之一，由于各种肝病导致的急、慢性肝功能衰竭，所致病死率高达70％～80％，多项研究表明，治疗急性肝功能衰竭及终末期肝病唯一有效手段是肝脏移植，但由于供体来源困难，在很大程度上限制了肝移植技术的广泛应用。异种肝脏移植是目前该领域研究的重点课题，而应用该方法移植的主要障碍是超急性排斥(Hyperacuterejection，HAR)，其本质是人类补体激活所造成的供体器官不可逆损伤、破坏。人类自身存在许多补体调节因子(complementregularfactor，CRF)，其中最有效的有衰变加速因子(decayacceleratingfactor，DAF)、CD59、膜辅助蛋白(membranecofactorprotein，MCP)。它们之间相互作用，一起有效控制补体的活化，保护宿主细胞免受补体介导的杀伤。 本课题组自2001年以来一直从事肝脏非病毒载体基因转移技术的研究，曾利用纳米微囊(nanosphere)包裹Luciferase报告基因，成功地制备出纳米微囊-报告基因复合体，通过体内、外转染大鼠肝细胞，对合成的载体进行了体内外的初步生物评价，认为壳聚糖(chitosan，CS)可以有效地介导基因转染细胞。在此研究基础上，我们构建人类CRF(DAF、CD59、MCP)真核表达载体，制备CS-DNA纳米微囊混合物，并进行了一系列体内、外的初步实验研究，以期观察人类DAF、CD59、MCP对异种细胞的保护作用，并为下一步的人工肝脏研究打下基础。 目的:通过CS纳米微囊载体进行人类CRF(DAF、CD59、MCP)的体外及体内基因转染，并观察人类DAF、CD59、MCP对异种组织细胞的保护作用。 方法:构建人类DAF、CD59、MCP真核表达载体pSecTag2/HygroB-DAF、pSecTag2/HygroB-CD59、pSecTag2/HygroB-MCP；利用CS组装成纳米微囊混合物，体外转染小鼠成纤维细胞系(NIH3T3)细胞24h，免疫组织化学法检测细胞转基因表达水平；用含有5％、10％人血清的DMEM分别培养未转染及转染CS-DNA(CS-DAF、CS-CD59及CS-MCP)纳米微囊混合物的NIH3T3细胞，流式细胞仪检测细胞凋亡情况，MTT比色法检测细胞活性，同时结合形态学及细胞增殖活性比较，对CS的毒性进行探讨；CS-DNA纳米微囊混合物经耳缘静脉注射，体内转染新西兰兔48h，利用免疫组织化学法检测肝脏转基因表达水平，同时结合形态学及细胞增殖活性比较，对CS的毒性进行探讨；进行离体肝脏灌注实验研究，为下一步DAF、CD59、MCP基因转染离体异种肝脏的研究打下基础。 结果:DAF基因大小为1049bp，MCP基因大小为1065bp，CD59基因大小为312bp，与genbank中记载的人DAF、MCP和CD59cDNA序列结果基本相同。抗DAF/CD59/MCP免疫组织化学染色结果显示：转染CS-DAF/CS-CD59/CS-MCP纳米微囊混合物后的NIH3T3细胞、兔肝组织均呈现弥漫性阳性，其中转染24h的NIH3T3细胞的阳性部位主要位于细胞质；转染48h的兔肝组织阳性部位主要位于细胞核。在形态学上，转染CS-DNA纳米微囊混合物后的肝组织及NIH3T3细胞，较转染前无明显差别；在细胞增殖活性上，转染CS-DNA纳米微囊混合物的肝组织及NIH3T3细胞，较转染前略有增高。MTT比色法结果显示：未转染CS-DNA混合物的各分组，经5％、10％人血清DMEM培养的活细胞数，较常规含10％胎牛血清DMEM培养组明显减少(P＜0.01)；10％人血清DMEM培养组的活细胞数明显低于5％人血清DMEM培养组(P＜0.01)；转染CS-DNA混合物的各分组间，存活细胞数无明显差异(P＞0.05)；经5％、10％人血清DMEM培养的两个分组之间，存活细胞数无明显差异(P＞0.05)。流式细胞仪结果显示：未转染CS-DNA纳米微囊混合物的NIH3T3细胞经常规含10％胎牛血清DMEM培养，细胞凋亡率为0.8％；转染CS-DNA纳米微囊混合物的细胞经5％人血清、10％人血清DMEM培养，细胞凋亡率为1.3％及1.8％；经5％、10％人血清DMEM培养的未转染细胞，细胞凋亡率分别为20％和46.9％；经10％胎牛血清DMEM培养的转染CS-DNA纳米微囊混合物NIH3T3细胞，凋亡率为1％。不同时间下，离体灌注的肝脏HE染色结果显示：与正常肝组织相比，灌注后2h肝细胞即出现糖原消耗现象，表现为细胞质淡染、出现空泡样变；4h肝细胞糖原消耗进一步加重，细胞质空泡样变更为明显，且发生空泡样变的细胞数目明显增多，甚至偶见小灶状的肝细胞坏死；8h肝细胞坏死灶逐渐增多，局部肝板断裂；16h坏死灶明显增大，肝板广泛断裂；24h肝细胞广泛坏死，但细胞核残存；32h肝细胞广泛凝固性坏死，细胞核消失。 结论:成功构建了人类DAF、CD59、MCP真核表达载体pSecTag2/HygroB-DAF、pSecTag2/HygroB-CD59、pSecTag2/HygroB-MCP。CS是一种较为有效、安全、无毒的非病毒类DNA载体，对细胞的增殖活性不会造成很大的影响。利用CS转染组织、细胞24h，主要呈现细胞质阳性，可能与细胞摄取CS-DNA纳米微囊后形成内涵体，并从内涵体释放入细胞质有关；转染48h，主要呈现细胞核阳性，说明CS-DNA纳米微囊可以在细胞核内大量聚集。通过静脉注射可以有效地将CS-DNA混合物转染肝脏组织。人血清对小鼠NIH3T3细胞具有明显的杀伤及诱导凋亡的作用，10％人血清杀伤作用明显高于5％人血清，可能与高浓度血清中含有的补体成分含量增多有关。利用CS将人类DAF、CD59、MCP共转染NIH3T3细胞后发现，人血清不能对小鼠NIH3T3细胞形成杀伤及诱导凋亡的作用，说明人类DAF、CD59、MCP的共转染，可以有效地保护小鼠细胞，不受到异种补体调节蛋白的攻击，提示该实验方法可以有效地防止异种器官移植中HAR的发生。不同时间离体灌注的肝脏HE染色结果显示，离体肝脏灌注时间最好不要超过4h。

目录

独创性声明及保护知识产权声明

中英文缩略词对照表（Abbreviation）

前 言

文献回顾一 衰变加速因子（DAF）、膜辅助蛋白（MCP）、CD59的研究现状以及在抗超急性排斥反应中的研究

文献回顾二 壳聚糖在基因转染中的应用及其研究现状

实验第一部分 人类DAF、CD59、MCP真核表达载体的构建及序列分析鉴定

实验第二部分 人类DAF、CD59、MCP转染小鼠成纤维细胞系（NIH 3T3）的实验研究

实验第三部分 人类DAF、CD59、MCP基因体内转染的初步实验研究

小 结

参考文献

个人简历及研究成果

致谢