类缺血再灌注对胚胎小鼠纹状体区神经干细胞活性、胞内钙离子浓度以及增殖能力的影响

摘要

本实验利用倒置显微镜、共聚焦显微镜等实验仪器，采用免疫荧光法、免疫双标记检测技术、MTT比色检测技术，借助类缺血再灌注模型，从胚胎小鼠、成年小鼠和新生小鼠纹状体区分离培养、鉴定神经干细胞(neuralstemcells，NSCs)；并比较胚胎小鼠、新生小鼠以及成年小鼠的纹状体区NSCs在体外的增殖及分化情况；观察体外类缺血再灌注对培养的NSCs细胞活性和胞内Ca2+浓度的影响，试图对于缺血缺氧对NSCs的损伤机制进行初步探索，并对类缺血再灌注后神经干细胞增殖情况进行初步观察。实验所得结果如下：　　1)通过原代培养可在无血清培养条件下获得悬浮生长的神经球，呈nestin染色阳性，神经球在血清诱导下贴壁后游出β-tubulin-Ⅲ、GFAP和Galc染色阳性细胞。 2)胚胎小鼠纹状体区NSCs增殖速度较新生鼠和成年鼠纹状体区NSCs快，与成年鼠的NSCs相比有显著性差异；三种来源的NSCs均可分化产生神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞，其中神经元和星形胶质细胞的比例在三者间无显著性差异。 3)类缺血再灌注后，类缺血再灌注组和氟桂利嗪预处理组胞内游离Ca2+浓度均逐渐升高，再灌注2h达到高峰，3h时已开始降低；在相同时间点氟桂利嗪预处理组胞内Ca2+浓度均低于类缺血再灌注组，其中0、30min、1h时有显著性差异P＜0.05。 4)类缺血再灌注后，类缺血再灌注组和氟桂利嗪预处理组细胞活性降低，在相同时间点氟桂利嗪预处理组细胞活性均高于类缺血再灌注组，其中0、30min、1、2h时差异显著P＜0.05。 5)再灌注6-48h类缺血再灌注组和氟桂利嗪预处理组的细胞吸光度A值逐渐升高，变化趋势较对照组明显P＜0.01，类缺血再灌注组和氟桂利嗪预处理组间无显著性差异。 试验结论如下： 1)培养获得的神经球在体外增殖迅速，nestin染色阳性，可在血清诱导下分化为神经元、星形胶质和少突胶质细胞，符合神经干细胞的基本生物学特征，在本实验中成功地建立了小鼠纹状体区神经干细胞的体外培养技术。 2)通过比较胚胎小鼠、新生小鼠以及成年小鼠的纹状体区NSCs在体外的增殖及分化情况，发现胚胎小鼠纹状体区NSCs增殖能力最强，是下一步的深入研究理想的实验对象。 3)类缺血再灌注可以引发NSCs内游离Ca2+浓度升高和细胞活性降低，氟桂利嗪预处理对胞内钙离子浓度升高有明显抑制作用，对细胞活性保护作用。

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缩略词表

摘要

前言

文献回顾

实验一胚胎小鼠纹状体区神经干细胞的分离、培养以及鉴定

实验二不同发育阶段小鼠纹状体区神经干细胞体外增殖和分化情况比较

实验三类缺血再灌注对体外培养神经干细胞活性、胞内钙离子浓度以及增殖的影响

结论

参考文献

致谢

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