促红细胞生成素在新生鼠缺氧缺血性脑损伤中的神经保护作用

摘要

背景:新生儿缺氧缺血性脑病(HIE)系新生儿窒息、缺氧所致的严重并发症，病情严重，病死率高，是引起新生儿死亡和神经系统发育障碍的主要原因之一。因此深入了解HIE发病机制及寻求更有效的治疗途径成为新生儿研究的热点之一。促红细胞生成素(EPO)是重要的造血因子，通过作用于红系前体细胞膜表面特异性EPO受体(EPO-R)刺激其增殖、分化及成熟。最近EPO的非造血作用逐渐被认识，目前已证实在中枢神经系统中也有EPO、EPO-R的基因表达，并发现EPO具有神经保护、神经营养及调节胚胎发育的作用，因此受到广泛关注，已成为诸多学者的研究热点。重组人红细胞生成素(rhEPO)是一种糖蛋白激素，作为重要的造血因子应用于临床已有20多年。但体外注射rhEPO在新生儿缺氧缺血性脑损伤(HIBD)中的神经保护作用及其机制仍不明确。本研究采用免疫组化、原位切口末端标记、放射免疫以及血生化检测的方法来研究在HIBD后腹腔注射rhEPO，海马CA1区神经细胞NR1蛋白的表达变化及神经细胞凋亡，并测定血浆及脑匀浆NO/ET的水平，从而探讨rhEPO在HIBD中的神经保护作用机制，为进一步探讨HIE的发病机制及临床治疗提供理论依据。 目的:研究体外注射rhEPO对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤后海马CA1区NMDA受体Ⅰ型亚单位(NR1)表达的影响及海马神经细胞凋亡的变化；检测血浆中内皮素，脑匀浆一氧化氮及一氧化氮合酶的表达，探讨rhEPO的大脑保护作用的机制，从而寻求临床治疗HIE的新途径。 方法: (1)动物模型的制备：7日龄SD大鼠114只随机分为3组：假手术(SO)组38只；缺氧缺血性脑损伤(HIBD)组38只；促红细胞生成素治疗(EPO)组38只。HIBD组与EPO组分别结扎右侧颈总动脉。缺血术后恢复2h，置于2000ml常温常压缺氧舱内，以1～2L·min-1的速度输入含80mL·L-1氧气和920mL·L-1氮气的混合气体，以氧浓度监测仪检测使氧浓度维持80mL·L-1，持续2h，建立HIBD的动物模型。EPO组于HI术后即刻腹腔注射(i.p.)rhEPO5000IU/kg；假手术对照组仅游离而不结扎右侧颈总动脉，不进行缺氧处理。 (2)组织标本的制备：三组新生大鼠分别于缺氧缺血后不同时间点断头处死新生大鼠，①取出脑组织于中性甲醛中固定12-24h制作石蜡切片；②测定各组新生鼠缺氧缺血(HI)后6h脑组织匀浆NO和NOS含量以及血浆中ET的水平。 (3)应用苏木素-伊红染色观察海马区脑组织的病理形态；采用SP免疫组化染色研究NR1蛋白的表达；原位切口末端标记的方法检测海马区凋亡细胞；放射免疫法测定血浆内皮素水平；生化检测脑匀浆中一氧化氮及一氧化氮合酶的含量。(4)数据以均数±标准差((x)±s)表示，采用SPSS10.0软件进行方差分析及t检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。 结论: 1.正常新生大鼠海马区有极少量的凋亡细胞，HIBD后凋亡细胞明显增多，而腹腔内给予rhEPO后可通过抑制细胞凋亡而对HIBD后的脑组织起到保护作用。 2.正常新生大鼠海马区有适量的NR1蛋白的表达，HIBD后NR1蛋白的表达有先升高后降低的趋势，而腹腔内给予rhEPO后对NR1蛋白表达有着双重的作用，即对急性期的降低谷氨酸的大量聚集所产生的神经毒性有抑制作用，而在HIBD后期可使大脑的信息传递功能恢复，提高神经元的营养，以利于脑功能恢复。 3.外源性rhEPO可通过减少NO的过量生成而对HIBD后的脑组织起到保护作用。其机制可能通过抑制NR1受体而间接起作用。

目录

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缩略语表

前 言

文献回顾

1.实验材料与仪器

2.实验方法

3.实验结果

4.统计学处理

5.讨论

小 结

参考文献

附录

个人简历

致谢