血管内皮生长因子基因转染骨髓间充质干细胞治疗缺血性心脏病的研究

摘要

尽管传统血运重建术取得了巨大进展，但缺血性心脏病的治疗仍然存在诸多不足。治疗性血管生成(therapeuticangiogenesis)通常所采用的两种方法，包括直接注射重组成血管因子的蛋白疗法和基于传递编码成血管因子基因的基因疗法。在众多的成血管因子中，血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)由于其在血管生成中的关键作用而被广泛研究，并且VEGF还表现出对心肌缺血损伤的保护作用。近来细胞移植促进血管生成研究是对治疗性血管生成方法的有效补充。骨髓来源的间充质干细胞(mesenchymalstemcells，MSCs)具有分化包括心肌细胞，内皮细胞在内的多种细胞的能力。并且，MSCs易于从骨髓中分离培养，体外扩增，是较为理想的种子细胞。在梗死心肌和缺血骨骼肌进行成肌细胞介导的成血管基因传送能同时获得肌肉生成和血管生成，因此被视为一种极具潜能的替代疗法。 在这些研究的基础上，我们假设VEGF基因转染的MSCs移植能有效增强缺血心肌的成肌和血管生成效应，进而导致心功能显著改善。为验证该假设，并为该方法的临床运用进一步做出铺垫性实验论证，我们进行了如下研究，共分为三部分： 第一部分：VEGF真核表达质粒pcDNA3.1(-)/hVEGF165的构建及鉴定目的：构建并鉴定VEGF真核表达载体pcDNA3.1(-)/hVEGF165。 方法：运用基因重组技术，构建重组质粒pcDNA3.1(-)/hVEGF165，并对其进行酶切鉴定，DNA序列测定。 结果：成功构建重组质粒pcDNA3.1(-)/hVEGF165。 第二部分：VEGF真核表达载体转染MSCs及其表达目的：研究VEGF真核表达质粒pcDNA3.1(-)/hVEGF165体外转染MSCs及VEGF在MSCs中的表达情况。 方法：体外分离、培养大鼠MSCs，对其进行表型及生长曲线测定。通过脂质体介导技术将pcDNA3.1(-)/hVEGF165转染MSCs，Western-blot，RT-PCR，ELISA及免疫细胞化学等方法检测VEGF在MSCs中的表达情况，MTT法检测转染后细胞上清液中VEGF的生物活性。 结果：体外培养MSCs呈典型成纤维细胞样外观，表面分子标记物表达CD44(96±0.5％)，CD90(98.5±0.2％)，CD34(5±0.2％)和CD45(1±0.3％)。Western-blot，RT-PCR检测转染MSCs表达VEGF蛋白和mRNA，ELISA检测转染组细胞上清VEGF表达显著增加(p＜0.05)，MTT法检测转染组细胞上清能显著促进人脐静脉内皮细胞增殖(p＜0.05)，免疫细胞化学染色结果显示转染组VEGF阳性细胞明显增多。 第三部分：VEGF基因转染MSCs移植治疗缺血性心脏病的研究目的：研究VEGF基因转染的MSCs移植对缺血心肌的成肌和成血管效应。 方法：60只近交系Wistar大鼠随机均分为以下四组：VEGF基因转染MSCs移植组(MSCs/VEGF组)，MSCs移植组(MSCs组)，pcDNA3.1(-)/hVEGF165注射组(VEGF组)，无血清培养基注射对照组(Control组)，结扎前降支建立急性心梗模型后在梗死区边缘区行8×106/30μl细胞移植，VEGF组行300μg/30μl质粒注射，对照组行等量无血清培养基注射。细胞移植前行CM-DiI标记。移植30d后行组织化学检测平均再生血管密度，梗死面积，移植MSCs分化情况，心脏B超、血流动力学参数测定检测心脏功能。 结果：30d后MSCs/VEGF组与MSCs组，VEGF组，Control组比较，平均再生血管密度，梗死面积，B超心脏功能测定，血流动力学参数测定均有显著改善(p＜0.001)。移植MSCs在局部可分化为desmin(+)，cTnT(+)细胞，表现出心肌细胞显型。极少数移植MSCs参与新生血管生成，新生血管成分绝大多数为宿主源性。 结论：1、成功构建重组质粒pcDNA3.1(-)/hVEGF165。 2、pcDNA3.1(-)/hVEGF165转染大鼠MSCs后能有效增加VEGF表达，并表现出较强的促内皮细胞增殖作用。 3、MSCs易于分离培养，体外扩增。 4、VEGF基因转染MSCs移植治疗能显著促进缺血心肌新生血管再生，但只有极少数移植MSCs参与新生血管生成，新生血管成分绝大多数为宿主源性。 5、移植pcDNA3.1(-)/hVEGF165转染的MSCs在缺血心肌可横向分化为心肌细胞，表现出心肌细胞显型，并能在一定程度上防止心室重塑。 6、VEGF基因转染MSCs移植能显著改善缺血心脏功能。

目录

独创性声明及保护知识产权声明

缩略词表

文献回顾

前 言

第一部分人血管内皮生长因子真核表达质粒pcDNA3.1(-)/hVEGF165的构建及鉴定

第二部分VEGF真核表达载体转染MSCs及其表达

第三部分VEGF基因转染MSCs移植治疗缺血性心脏病的研究

全文小结

参考文献

个人简历

致 谢