Notch信号通路在肝癌发生发展中的作用及机制研究

摘要

【研究背景】 肝细胞癌（HCC，以下简称肝癌）是最常见的恶性肿瘤之一。我国肝癌的主要病因为乙型肝炎病毒（HBV）感染，但其发生发展的分子机制尚未完全清楚。Notch 信号是一个在进化中高度保守的反映细胞间通讯机制的通路，它调控细胞的分化和增殖，在胚胎发育和细胞命运的决定中发挥重要的作用。有研究表明Notch 信号也参与肿瘤的发生发展，Notch 受体和配体分子表达失调以及Notch 信号的异常激活出现在一系列恶性肿瘤中。目前为止，Notch 信号在肝癌中的作用及机制尚未见报道。 【目的】 1. Notch 受体和配体分子在人原发性肝癌中的表达；2. Notch 信号与乙型肝炎病毒X 蛋白（HBx）的关系；3. Notch 信号对肝癌细胞恶性生物学行为的影响及其机制。 【方法】 1. 采用免疫组织化学方法检测Notch 受体和配体分子在人原发性肝癌组织的表达，并分析上述分子的表达与肝癌患者临床病理学参数以及与HBx 表达之间的关系；2. 采用RT-PCR 及Western Blot 方法检测稳定转染野生型HBx 基因的HepG2 细胞（HepG2X）中Notch 受体和配体分子的表达；3. 分别用Ras 及其下游信号分子MEK、PI3K 以及p38 的特异性抑制剂处理HepG2X 细胞，Western Blot 检测相关Notch 分子的表达；4. 采用共聚焦显微术以及免疫共沉淀技术检测Notch 分子与HBx 的表达共定位和蛋白分子相互结合关系；5. 用双荧光素酶报告基因实验检测HBx 对Notch 信号的激活作用；6. 采用正义基因转染、RNAi 技术改变肝癌HepG2 和SMMC7721 细胞中Notch1 的表达水平，建立稳定转染细胞系；7. 用Notch信号的特异性抑制剂处理SMMC7721 以及HepG2X 细胞，得到整个Notch信号被抑制的细胞模型；8. 利用MTT 方法对上述转染子及抑制剂处理的细胞进行生长曲线的描绘，用平板克隆形成实验检测其单细胞克隆形成能力，软琼脂克隆形成实验检测锚定非依赖性生长的能力，裸鼠成瘤实验检测上述转染细胞在体内形成移植瘤的能力；9. 采用PI 染色流式细胞术检测上述转染细胞及抑制剂处理细胞的周期的变化，用Annexin ⅴ/PI 双染色流式细胞术、DAPI 染色、透射电镜技术以及TUNEL 染色检测其凋亡情况；10.用基因芯片技术筛选Notch 信号相关的差异表达基因。 【结果】 1. Notch1、Notch2、Notch4 及Jagged1 在肝癌中表达失调免疫组化结果显示Notch1、Notch2、Notch3、Notch4 及其配体Jagged1、Delta4 在人原发性肝癌组织的肿瘤细胞中存在强弱不等的表达，其中Notch1和Notch4 表达于胞浆和胞核中，Notch1 主要表达于胞浆，其阳性率为88.7％(47/53)，少数几例表达于胞核，阳性率为9.4％ (5/53)；Notch4 在胞浆和胞核中的表达情况相当，阳性率分别为67.9％ (36/53)和58.5％ (31/53)，其余分子Notch2、Notch3 及Jagged1、Delta4 仅表达于胞浆，阳性率分别为26.4％(14/53)、52.8％ (28/53)、79.2％ (42/53)和67.9％ (36/53)。与癌旁组织相比，胞浆Notch1、核Notch4 以及Jagged1 在肝癌组织中呈高表达，Notch2 在肝癌中低表达，其余分子表达无明显变化。与临床病理学资料相关性的统计学分析显示Notch2、Notch3、Jagged1 和Delta4 的表达与患者年龄显著正相关，Notch1（胞浆）、Notch2、Notch3、Jagged1 及Delta4 的表达与肿瘤的分化程度显著相关；在HBV 阳性的乙肝相关肝癌中Notch1（胞浆）、Notch4（胞核）及Jagged1 的表达与HBx 的表达呈显著正相关。 2. 肝癌中Notch 信号受HBx 调节在组织学研究的基础上，进一步检测了Notch 受体和配体分子在体外培养肝癌细胞系中的表达，发现与组织中相一致的结果：上述Notch 受体和配体分子的mRNA 和蛋白在HepG2X 和对照细胞中均有表达，在mRNA 水平，HepG2X 中Notch1 和Jagged1 的表达显著高于对照细胞；在蛋白水平HepG2X 中Notch1 的跨膜域（NTM1）、Notch4 的胞内域（ICN4）及Jagged1的表达均显著高于对照细胞，其余分子表达与对照细胞无明显差异。用Ras或p38 的特异性抑制剂处理HepG2X 细胞可导致其Notch1 的表达下调，而MEK 和PI3K 的抑制剂处理不能影响Notch1 的表达，Ras 的抑制剂不能影响Notch4 及Jagged1 的表达，显示HBx 通过Ras-p38 通路调节Notch1 的表达。 检测Notch1、Notch4 和Jagged1 与HBx 的共定位和相互作用情况，结果发现在乙肝相关肝癌组织以及HepG2X 细胞胞浆中Notch1 和Jagged1 与HBx 分别存在表达共定位现象，在HepG2X 细胞中Notch1 和Jagged1 分别与HBx 存在蛋白分子相互结合关系。双荧光素酶报告基因实验显示HBx 可以一种剂量依赖的方式直接激活肝癌HepG2 细胞中Notch 信号。 3. Notch 信号通过加快细胞周期进展、抑制细胞凋亡从而促进肝癌细胞的恶性生长和增殖行为对五株肝癌细胞系中Notch1 表达水平的检测发现其在HepG2 细胞中表达较低，在SMMC7721 中水平较高。稳定转染Notch1 胞内域（ICN1）的真核表达载体后，HepG2 细胞的生长增殖能力、单细胞克隆形成能力、锚定非依赖性生长的能力以及裸鼠体内成瘤能力增强，细胞周期G1-S 期的进展加快，细胞凋亡减少；而稳定转染Notch1-siRNA 的SMMC7721 细胞则出现上述生存能力下降，细胞周期G1-S 期阻滞，细胞凋亡显著增加。用Notch 信号的特异性抑制剂处理Notch 信号活性较强的SMMC7721 和HepG2X 细胞后，同样发现细胞的生长增殖能力、单细胞克隆形成能力、锚定非依赖生长的能力较弱，细胞周期阻滞，细胞凋亡显著增多。基因芯片技术检测ICN1 引起HepG2 细胞中差异表达的分子，结果显示ICN1 的异源性表达可引起HepG2 细胞中一些影响细胞生长和迁移的分子表达失调。 【结论】 1. Notch 信号分子在肝癌中的表达及意义：Notch1、Notch2、Notch4 及Jagged1 在肝癌与癌旁组织中差异表达，可能参与肝癌的发生发展；2. Notch信号与HBx 的关系：HBx 可调控Notch1、Notch4 及Jagged1 的表达和功能并激活Notch 信号；3. Notch 信号对于肝癌细胞恶性生物学行为的影响及机制：Notch 信号增强可促进肝癌细胞的生长增殖能力，加快细胞周期进展，减少细胞凋亡，Notch 信号的抑制可减弱肝癌细胞的生长增殖能力，阻滞细胞周期进展，促进细胞凋亡，这些作用可能与其调控一些影响细胞生长增殖的分子有关。Notch 信号促进肝癌的发生发展，肝癌中Notch 信号受HBx的调节，参与HBx 的致癌通路。