突变型Axin基因在神经胶质瘤细胞系C6中的功能研究

摘要

Axin是1997年发现的小鼠Fused基因的编码产物，它在胚胎早期通过特异性抑制Wnt通路，而抑制胚胎体轴的形成，故得名Axin（axis inhibition）。Axin是一个支架蛋白，具有多个结合位点，可以与信号转导途径中多个成员结合构成复合物，在多条信号转导通路间发挥调节作用。随着研究的深入，Axin至少在Wnt，SAPK/JNK，TGF-β以及p53 四种信号通路中发挥重要作用。其生物学功能涉及胚胎发育、神经元分化、肿瘤形成、细胞凋亡、糖原代谢等方面。特别是近年来，Axin作为肿瘤抑制因子，引起人们广泛的兴趣。已经在一些肿瘤中检测到Axin基因的突变，如肝细胞癌、结肠癌、髓母细胞瘤等。Axin过表达的转基因小鼠中出现不同组织器官大量细胞死亡，腺病毒感染野生型Axin基因到肿瘤细胞，可导致肿瘤细胞凋亡。 我们实验室在人胶质瘤组织中检测到Axin基因第10个外显子发生错义突变，突变率为21.4％，其中DNA位点20801g-a（Genbank AE006463）突变例数最多。而后，我们又证实野生型Axin基因的表达可抑制胶质瘤细胞C6的增殖并诱导其凋亡。胶质瘤是神经系统常见的恶性肿瘤。原癌基因激活，抑癌基因失活是肿瘤产生、发展的主要原因，因此，研究抑癌基因Axin的突变是否影响了其抑制C6细胞增殖的功能以及是否与胶质瘤的发生发展相关，将有助于我们进一步探讨胶质瘤的发病机理。 目的：研究突变型Axin基因对C6细胞增殖能力及细胞周期的影响，以期揭示突变型Axin基因在胶质瘤细胞C6中功能是否发生改变。 方法： （1）用分子克隆技术，构建鼠突变型Axin基因真核表达载体Pires2-EGFP-MT-Axin； （2）采用MTT比色法、平板集落形成实验方法及流式细胞仪测定细胞周期，观察细胞的增殖能力及细胞周期的变化； （3）采用免疫细胞化学方法观察Ki67、CyclinD1蛋白表达的改变。 结果： （1）成功构建了突变型Axin基因真核表达载体Pires2-EGFP-MT-Axin，并建立了稳定表达突变型Axin基因的胶质瘤细胞C6细胞株。 （2）通过MTT实验发现，转染突变型Axin基因与转染野生型Axin基因的C6细胞生长速度与转染空载体组相比均显著降低（P=0.043、P=0.032），野生型与突变型组间无显著差异（P=0.881）。 （3）流式细胞仪检测细胞周期发现：C6、C6-Vector 、C6-Vector-WT-Axin 和C6-Vector-MT-Axin处于G1期比例分别为：60.9％、65.4％、75％、70.7％，处于S期的细胞比例分别为：27.2％、24.8％、18.9％和18.5％。C6-Vector-WT-Axin 和C6-Vector-MT-Axin细胞均出现G1期被阻滞，S期比率下降。 （4）细胞集落形成实验结果表明：C6、C6-Vector、C6-Vector-WT-Axin 和C6-Vector-MT-Axin集落形成率分别为：39％、25％、7％和8％。转染野生型Axin细胞与转染突变型Axin细胞之间集落形成能力无差别（χ2=0.072，P=0.788）。 （5）Ki67、cyclinD1阳性反应物均定位于细胞核，Ki67在转染野生型Axin与突变型Axin后的阳性表达率均显著低于转染空载体组（χ2 值分别为40.737、53.592，P<0.01）, 而转染野生型与突变型Axin 细胞间Ki67的表达无差别（χ2=2.918，P>0.01）。cyclinD1在转染野生型与突变型Axin基因的细胞中阳性表达率亦均显著低于转染空载体组（χ2 值分别为55.730、22.523，P<0.01）, 而转染野生型Axin细胞与突变型Axin 细胞间cyclinD1的表达无差别（χ2=5.703，P>0.01）。 结论：突变型Axin基因明显抑制C6细胞的增殖能力，并且转染突变型Axin基因的细胞与转染野生型Axin基因的细胞，在细胞生长与增殖能力方面均显著降低，两者未见显著差别。因此，胶质瘤中发现的DNA位点20801g-a（Genbank AE006463）突变没有影响Axin基因抑制C6细胞增殖的功能。