ABCG2在肺癌中的表达及EGF、IL-4对肺腺癌细胞ABCG2表达调节的研究

摘要

一、目的和意义: 肺癌是最常见的恶性肿瘤之一。在全球范围内，肺癌的防治形势十分严峻，其发病率和病死率在世界各地呈现上升趋势。目前肺癌缺乏有效的治疗方法，如何改善肺癌的治疗状况是亟待解决的重要问题。肺癌包括小细胞肺癌和非小细胞肺癌，在肺癌的综合治疗中，化疗是最基本的治疗方法，也是不可缺少的重要手段。但在肺癌化疗过程中，有两大瓶颈制约着化疗效果。一是化疗药物的毒副作用使临床使用受到限制。二是肿瘤细胞产生耐药性，尤其是多药耐药性是导致化疗失败的重要因素，在很大程度上制约了化疗的临床效果。 多药耐药（multidrug resistance, MDR）的产生与多药耐药基因、多药耐药蛋白表达增多密切相关。这些多药耐药蛋白多为膜转运体ABC（ATP binding cassette, ABC）超家族。ABC超家族是一种由多种转运体组成的，在机体内广泛表达的大家族。在人体，已有几十种ABC转运体被鉴定。ABC超家族成员可以转运大量的物质如离子、糖、氨基酸、多肽、蛋白质、磷脂、毒素和药物。其中MDR1（multidrug resistance protein1）、MRP1（multidrug resistance associated protein1）和BCRP（breast cancer resistance protein）是三种主要参与肿瘤耐药的转运体。BCRP基因是近年来发现的一个MDR基因，在人命名为ABCG2基因，其表达产物与典型的ABC转运蛋白不同的是只含有一个ATP结合结构域和一个疏水性的跨膜结构域，因此称其为半转运蛋白。ABCG2主要通过结合和水解ATP并利用能量将胞内的药物泵出，降低胞内药物浓度从而导致耐药。近年研究发现，ABCG2与肿瘤耐药密切相关，但ABCG2与肺癌的相关研究较少，同时ABCG2在肺癌表达的调节研究未见报道。在借鉴前人研究的基础上，探讨ABCG2在不同类型肺癌中的表达及其与临床病理学的相关性；在此基础上，进一步研究ABCG2在肺腺癌细胞系的表达，同时探讨EGF、IL-4对ABCG2表达与功能的调节，初步揭示肺腺癌多药耐药的发生机制，为肺腺癌耐药的治疗提供理论依据。 本研究主要以人肺癌病理标本、胸膜间皮瘤病理标本及现有肺腺癌细胞系为研究对象，从组织、细胞及分子水平观察ABCG2与肺癌的相关性，并进一步探讨ABCG2对肺癌的调节机制。 二、材料与方法: 1、采用免疫组织化学法检测83例不同类型肺癌组织ABCG2表达水平，分析ABCG2表达与临床病理学的相关性。 2、采用免疫组化方法对26例胸膜间皮瘤进行ABCG2检测，并与肺腺癌组织ABCG2表达结果比较。 3、应用RT-PCR和流式细胞仪检测ABCG2在肺腺癌细胞株中表达。 4、应用real-time PCR检测肺腺癌组织中ABCG2与EGFR的表达水平，分析肺腺癌组织中ABCG2与EGFR表达的相关性。 5、应用流式细胞仪检测肺腺癌细胞株中ABCG2与EGFR的共表达。 6、应用real-time PCR、western-blot和MTT观察EGF对肺腺癌细胞株ABCG2表达与功能的影响，分析ABCG2表达改变与细胞耐药的相关性。 7、应用RT-PCR及western-blot观察IL-4对SPC-A-1细胞ABCG2表达的影响。 三、结果: 1、83例肺癌中，免疫组化显示非小细胞肺癌ABCG2阳性率71.88％（46/64），明显高于小细胞肺癌（SCLC）10.53％（2/19）（P<0.05）；腺癌中ABCG2的表达高于鳞癌，但没有统计学意义。 2、非小细胞肺癌中ABCG2表达与性别、肿瘤大小、TNM分期均无关，但ABCG2在无淋巴结转移和有淋巴结转移的非小细胞癌中表达分别为54.17和82.50％，二者比较有统计学意义（P<0.05）；同时ABCG2表达与非小细胞癌分化程度也相关（P<0.05）。 3、ABCG2染色在26例胸膜间皮瘤中有2例阳性表达，表达率7.69％。 4、A549和SPC-A-1细胞ABCG2 mRNA的表达的相对量分别为2.46±0.07和1.53±0.05, A549细胞中该基因表达略强于SPC-A-1细胞（P<0.05）。 5、34例肺腺癌中均有ABCG2 and EGFR mRNA 表达。平均目标基因表达水平：ABCG2 0.959（范围：0.005-3.721），EGFR 1.299（范围：0.009-7.224）。ABCG2 mRNA表达水平与EGFR mRNA表达水平明显相关（r=0.609, P <0.001）。 6、A549和SPC-A-1细胞ABCG2阳性表达率分别为10.21±1.34％和6.32±0.81％，ABCG2和EGFR双标细胞率分别为7.05±1.21％和5.49± 0.85％。 7、Real-time PCR和Western-blot结果，人肺腺癌A549 和SPC-A-1细胞经EGF作用后ABCG2表达增加。 8、MTT结果观察到经EGF作用后ABCG2表达增加的A549 和SPC-A-1细胞对某些浓度topotecan的耐药性与对照组相比明显增加。 9、半定量RT-PCR及Western-blot结果观察到IL-4对SPC-A-1细胞株ABCG2表达无明显影响。 四、结论: 1、ABCG2很少表达于小细胞肺癌。 2、ABCG2明显表达于非小细胞肺癌，而正常肺组织基本上不表达ABCG2。ABCG2在非小细胞肺癌的发生、发展过程中可能起重要作用，而且ABCG2强阳性表达可能与耐药相关。 3、在非小细胞肺癌中ABCG2表达与性别、肿瘤大小、TNM分期均无关，但ABCG2与非小细胞肺癌的分化程度及淋巴结转移有关。ABCG2阳性表达可能与非小细胞肺癌的侵袭及较高的恶性生物学行为相关。 4、ABCG2很少表达于恶性胸膜间皮瘤；ABCG2抗体的免疫组化对间皮瘤和肺腺癌之间的鉴别诊断具有一定的价值。 5、在mRNA水平ABCG2在腺癌组织存在表达，而在癌旁组织及正常肺组织中表达较少。在mRNA及蛋白水平，两个腺癌细胞系中均存在ABCG2的低表达。 6、EGF调节肺腺癌细胞ABCG2表达，这种调节作用进一步影响这些肺腺癌细胞的耐药特征。由此初步揭示了EGF、EGFR、ABCG2与肺癌耐药的相关性，对非小细胞肺癌的治疗特别是肺腺癌的治疗具有重要意义。 7、IL-4对肺腺癌细胞株SPC-A-1 ABCG2表达无调节作用。