ABCG2在肺癌中的表达及其对肺癌细胞生物学行为的影响

摘要

研究背景和目的 国内外肺癌的发病率和死亡率持续上升，在人口密度较高的工业城市尤为显著；在男性肿瘤死因中已居首位，在女性中仅次于乳腺癌居第二位，且有年轻化趋势，而肺癌的治疗和预后不容乐观。因此深入研究肺癌的病因、发病机制，探索有效的防治方法已是当前肿瘤研究的首要任务。 ABCG2是ABC转运蛋白超家族(ATPbindingcassettetransportersuperfamily)成员之一，是1998年从耐药的乳腺癌细胞中克隆，并引起耐药的基因，所以又叫乳腺癌耐药蛋白(BCRPbreastcancerresistanceprotein)基因。与其他研究小组发现的MXR(mitoxantroneresistanceprotein)和ABCP(placentalABCprotein)有着结构和序列的相似性，同属于ABCG基因家族，因此人类基因组命名委员会将其统一命名为ABCG2。 ABCG2蛋白是半转运蛋白，由6个跨膜螺旋结构域和一个氨基端胞内核酸结合结构域以及相应的一个ATP-bindingcassette组成，因此要通过与自身或其他半转运体组成同型或异型二聚体或多聚体后才能发挥作用。包括ABCG2在内的转运蛋白超家族正是通过转运复合体的形成在宿主对异物的防御和肿瘤细胞对抗癌药物的耐药性中起重要作用。 研究还发现ABCG2／Berp1与造血干／祖细胞泵出Hochest33342染料的特性有关。部分干细胞和癌细胞可以将Hochest33342排出细胞，表现为核不着色或着色很少，流式细胞仪可以将不着色细胞分离，分离出的这部分细胞称为SP细胞。目前认为ABCG2就是SP细胞的表型标志，是潜在的干细胞标志物。 因此，ABCG2既是一个新的耐药基因，又和SP细胞、肿瘤干细胞密切相关，研究其在肺癌中的表达，分析其与临床病理特征的关系，揭示其对肺癌细胞基本生物学特性的影响，有助于深入研究ABCG2与肺癌的关系，可能会为肺癌的发生和防治提供新策略。 方法： 1.ABCG2在肺癌中表达的定量研究 (1)应用免疫组化(SP法)观察了86例肺癌(鳞癌42例、腺癌31例、大细胞癌5例，小细胞癌8例，其中伴淋巴结转移者33例)和24例癌周肺组织(距肿物5cm)ABCG2蛋白的表达： (2)应用原位杂交观察了86例肺癌组织中(鳞癌42例、腺癌31例、大细胞癌5例，小细胞癌8例)ABCG2mRNA的表达： (3)应用显微图像定量分析，测试靶细胞ABCG2蛋白及mRNA表达的阳性单位(PU)值。 2.ABCG2基因沉默对肺癌细胞体外生物学特性的影响 (1)在倒置显微镜下观察肺腺癌细胞GLC-82和A549的形态学特点；应用HE细胞爬片和组织切片比较二者形态异同；应用免疫细胞化学、细胞原位杂交、RT-荧光定量PCR、western-blot和Hoechst33342染色比较GLC-82和A549中ABCG2基因表达程度。 (2)应用基因转染方法，将含有不同片段的4个干扰质粒、一个阳性对照质粒和一个阴性对照质粒，通过脂质体分别转入GLC-82，用G418反复筛选纯化克隆。用RT-PCR法鉴定阳性对照中GAPDH的干扰效率，再用RT-荧光定量PCR(RT-QPCR)法鉴定各干扰各隆的干扰效率，并通过免疫细胞化学和westernblot验证。 (3)应用MTT法测OD值并绘制细胞生长曲线，流式细胞术检测细胞周期分布，克隆形成实验检测单细胞克隆形成率，比较干扰前后细胞生长增殖能力的改变；应用划痕实验观察细胞迁移速度，观察ABCG2沉默对肺癌细胞转移能力的影响；应用倒置显微镜、细胞爬片、扫描电镜和透射电镜观察干扰前后细胞的形态学改变：应用MTT法检测干扰前后细胞对顺铂耐药性的改变。 3.ABCG2基因沉默对肺癌细胞皮下成瘤的影响 通过动物实验裸鼠皮下成瘤观察干扰前后细胞成瘤过程和成瘤能力的变化，绘制体内生长曲线，行HE染色观察其组织学形态的变化。 结论： 1.ABCG2在不同类型和分化的肺癌中表达不同，可作为肺癌分型和判断肺癌分化程度的指标之一。 2.ABCG2表达与肺癌患者的性别、年龄、转移和TNM分期无关，与肺癌分化程度有关，提示ABCG2在肺癌耐药中起一定作用。 3.从蛋白和mRNA水平及功能方面证实了ABCG2在GLC-82中表达高于A549。 4.建立了稳定的ABCG2基因沉默细胞株，为后续实验提供了理想的细胞模型。 5.ABCG2基因沉默致肺癌细胞增殖变缓且对顺铂耐药性降低，提示其对肺癌细胞生物学特性有一定影响，这有助于进一步揭示ABCG2与肺癌之间的关系。 创新之处： 1.首次从定量角度揭示了ABCG2蛋白和mRNA在肺癌中表达的特点及规律。 2.建立了稳定的ABCG2表达沉默的肺癌细胞株，为肺癌的体外研究提供了理想的细胞模型，为各种肺癌动物实验模型的建立奠定了基础。 3.首次系统性地研究ABCG2基因对肺癌细胞生物特性的影响，为深入研究肺癌的发生和治疗奠定基础。

目录

文摘

英文文摘

声明

前言

第一章ABCG2在肺癌组织中表达的定量研究

第一节ABCG2蛋白在肺癌组织中表达的定量研究

第二节ABCG2mRNA在肺癌组织中表达的定量研究

参考文献

第二章ABCG2基因沉默对肺癌细胞体外生物学特性的影响

第一节ABCG2基因在不同肺癌细胞株中的表达

第二节ABCG2基因沉默肺腺癌细胞株的建立

第三节ABCG2基因沉默对肺癌细胞体外生物学特性的影响

参考文献

第三章ABCG2基因沉默对肺癌细胞成瘤的影响

全文小结

攻读学位期间研究成果

附录主要实验材料、试剂、仪器及相关溶液的配制

致谢