兔抗人CIDE-3蛋白多克隆抗体的制备及应用

摘要

细胞凋亡是一种由多种基因共同调控的自身编码的死亡方式，确保了正常的胚胎发育和机体内环境的自身稳定。在形态学上，DNA的片段化为细胞凋亡的特征性表现。DFF40（DNA fragmentation factor 40）是一种DNA酶，在DNA片段化过程中发挥着关键性的作用。CIDE（cell death-inducing DFF45-like effector）家族蛋白同DFF蛋白在多肽链的N端具有同源性，是细胞凋亡诱导因子中的一个新成员，现在已知的CIDE蛋白中，人类有CIDE-A、CIDE-B和CIDE-3。其中人CIDE-3基因于2003年发现，其在GenBank中的登录号为AC007783，位于人类3p25染色体上，全长约169 kb，人CIDE-3基因cDNA含有1305个碱基，存在选择性剪切，具有诱导细胞凋亡的功能。但是，人CIDE-3基因在组织中的分布、其生理和病理功能以及与细胞凋亡的关系目前还不清楚。 为此本研究通过RT-PCR方法获得人CIDE-3的编码区基因，构建原核表达载体，经测序和酶切鉴定后，转化大肠杆菌进行体外表达，获得了人CIDE-3原核表达蛋白。免疫新西兰大白兔，制备出多克隆抗体，经鉴定后，应用免疫组织化学法初步了解了人CIDE-3蛋白在人类部分正常组织和部分肿瘤组织中的分布。 本文研究结果： 1. 构建了原核表达载体pET28a(+)-CIDE-3。经酶切鉴定和DNA 测序，目的基因片段的序列同GenBank中登录的相应序列完全吻合。 2. 在大肠杆菌中表达了人CIDE-3蛋白N端的172个氨基酸，由Ni-NTA Agarose (pH 8.0)纯化。SDS-PAGE和Western blot证实获得了纯化的人CIDE-3蛋白。 3. 制备兔抗人CIDE-3蛋白多克隆抗体，ELISA结果显示，该多克隆抗体效价高于1:30000，具有较高的亲和性；Western blot结果显示，该多克隆抗体可以与人CIDE-3蛋白特异性结合。免疫组织化学染色，结果显示人CIDE-3蛋白分布于部分胃粘膜上皮细胞的细胞质中，属于细胞质蛋白；通过比较胃组织连续切片的免疫组织化学染色片和HE 染色片推测阳性细胞可能为胃粘膜壁细胞。 4. 人CIDE-3蛋白阳性表达于肾脏肾小管上皮细胞（5/5例）（肾皮质2例、肾髓质3例阳性染色）；食道粘膜鳞状上皮细胞（5/5例）、心肌（4/5例）、结肠粘膜上皮细胞（7/10例）、胰腺（3/5例）（胰岛1例、胰腺外分泌腺体2例阳性染色）和肝（2/5例）。阳性物质均位于细胞胞质中，呈棕黄色颗粒状。脑（0/5例）和肺组织（0/5例）未见阳性细胞。 5. 人CIDE-3蛋白还存在于原发性肝细胞癌（hepatic cell carcinoma，HCC）（10/37例）、胃腺癌（4/19例）和乳腺癌（1/17例），HCC细胞中人CIDE-3蛋白的阳性表达率（10/37例）显著低于癌旁肝细胞（28/29例）（P<0.05），其中各分化阶段HCC细胞（高、中、低分化）中人CIDE-3蛋白的阳性表达率分别低于癌旁肝细胞（P<0.05）。 综上所述，本研究构建了人CIDE-3基因的原核表达载体，体外表达并纯化了人CIDE-3蛋白，制备了多克隆抗体。并初步了解了人CIDE-3蛋白在人部分正常组织和部分肿瘤组织中的表达情况，为今后研究人CIDE-3基因和蛋白的功能奠定了基础，为肿瘤的诊断、预防和治疗提供了新的思路。