兔抗人凝血因子ⅩⅢA亚单位多克隆抗体的制备、鉴定及应用研究

摘要

本文研究目的：采用免疫动物方法制备FⅩⅢ A亚单位多克隆抗体，并对其进行鉴定，检测其特异性及活性，并将多克隆抗体应用于FⅩⅢ缺乏的检测和FⅩⅢ抗原表位分析，为进一步研究FⅩⅢ抑制物作用机制奠定基础。 研究方法： 1．免疫动物法制备多克隆抗体。 2．Dot blot鉴定抗体，抗体中和／尿素溶解实验检测多克隆抗体活性。 3．Western blot检测FⅩⅢ缺乏及dot blot分析抗原表位。 研究结果： 1．(1)以兔抗人FⅩⅢ抗血清孵育过夜的PVDF膜在纯化的人FⅩⅢ、含转氨酶活性位点多肽Ⅱ点样处均出现阳性信号，而在含钙离子结合位点多肽Ⅰ点样处无阳性信号。 (2)正常血浆与兔血清(0ul，10ul，40ul，80ul)混合孵育，加入CaCl<,2>溶液后，4管均有血浆纤维蛋白凝块形成，大小基本相同，再加入5M尿素溶液1h后，第1管纤维蛋白凝块基本无变化，而第2，3，4管均有不同程度的缩小，且缩小的程度依抗血清量的增加依次递增。 2．(1)用纯化的人FⅩⅢ蛋白、正常血浆电泳转膜后的PVDF膜上，当用制备的抗血清作一抗、用辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG作二抗，在82.5KD的位置均有阳性信号，而FⅩⅢ缺乏病例1血浆在82.5KD的位置处有较弱的阳性信号，FⅩⅢ缺乏病例2血浆在82.5KD的位置处没有阳性信号。 (2)以FⅩⅢ缺乏病例1血清孵育后，再加兔血清孵育过夜的PVDF膜在含转氨酶活性位点多肽Ⅱ点样处出现阳性信号；纯化的人FⅩⅢ和含钙离子结合位点多肽Ⅰ点样处均无阳性信号。而以FⅩⅢ缺乏病例2血清孵育后，再加兔血清孵育过夜的PVDF膜在纯化的FⅩⅢ、含钙离子结合位点多肽Ⅰ、含转氨酶活性位点多肽Ⅱ点样处均未见阳性信号。 研究结论： 1.用免疫动物法成功制备了针对FⅩⅢA亚单位转氨酶活性位点的兔抗人多克隆抗体，此抗体不仅可特异性与纯化的人FⅩⅢ及含转氨酶活性位点多肽结合，而且在体外可以抑制人FⅩⅢ活性。 2.应用此抗体可检测FⅩⅢ缺乏，且分析出FⅩⅢ缺乏病例2的血浆中FⅩⅢ抑制物作用位点为转氨酶活性位点，而FⅩⅢ缺乏病例1的血浆中FⅩⅢ抑制物作用位点不是转氨酶活性位点。

目录

文摘

英文文摘

声明

前言

第一部分兔抗人FXⅢ多克隆抗体的制备及鉴定

1.1材料与方法

1.2结果

1.3讨论

第二部分兔抗人FXⅢ抗体在检测病人FXⅢ缺乏及FXⅢ抑制物作用表位中的应用

2.1研究对象

2.2材料与方法

2.3结果

2.4讨论

小结

参考文献

综述 抗体制备技术的研究轨迹及进展

致谢