正常机体内广泛存在并具有重要的功能，以往的观点认为其对AID的发生具有保护作用，特别是利用分泌型IgM缺陷小鼠进行的研究提示NAA在清除凋亡细胞、抑制AID的发生中具有重要作用。另一方面，有研究认为NAA也可能因为滴度、亲和力、特异性等的改变参与了自身免疫病的发生，并加速自身免疫病的进程。目前，关于NAA 和病理性自身抗体的区别以及NAA在病理性自身免疫中的作用是免疫学及相关学科关注的热点之一。 利用已建立的天然抗角蛋白自身抗体转基因小鼠(anti-keratin autoantibody，AK auto Ab)，对AK auto Ab的病理意义进行了初步分析。本研究组对NAA家族之一的AK auto Ab进行了多年细致、深入地研究，明确了AK auto Ab的诸多特性。在此基础上，应用未免疫小鼠B细胞与骨髓瘤细胞融合，成功筛选到了分泌AK auto Ab的杂交瘤3B4；在随后的实验中，发现3B4由未突变的胚系基因编码，具有广泛的多反应性，符合NAA的特性；通过克隆AK auto Ab的可变区基因构建了转基因（Tg）小鼠，为进一步研究NAA的产生机制、功能意义等问题提供了良好的实验平台。我们共获得了3系具有较高血清AK auto Ab滴度的Tg小鼠，每系均具有相似的表型。本研究对常规饲养环境下39系20周龄以上小鼠的表型变化进行了系统而全面的分析，为阐明NAA可能的病理意义进行积极的探索。 一、常规环境下AK auto Ab 重链Tg小鼠的表型分析 1．AK auto Ab Tg小鼠基因型的鉴定、传代、筛选和维持根据本研究小组前期实验所设计的两对引物对小鼠基因型进行鉴定。第一对引物应该扩增出460bp条带；而第二对引物应该扩增出200bp条带。实验证明第二对引物特异性较强。ELISA法检测小鼠血清中的抗角蛋白IgM滴度和总IgM 滴度，最终选择了抗角蛋白IgM水平显著增高的39系转基因小鼠进行进一步研究。 2．AK auto Ab Tg小鼠的大体表现在20周龄前，Tg小鼠与同窝对照（WT）小鼠表型无明显差别。20周龄以后，Tg小鼠逐渐出现病态表现：明显消瘦，颈椎前突，弓背畸形，体毛皱褶，摄食减少，活动能力差，生存时间缩短，体重减轻明显；脾大，脏器与体重比增大，尤其以雌性小鼠更为常见。 3. AK auto Ab Tg小鼠相关实验室检查 ①血常规和血生化。由尾静脉和眼球静脉取血，分别在全自动血球分析仪和生化分析仪上检测血常规和血生化。血常规示Tg小鼠血小板（PLT）计数升高，淋巴细胞绝对值（LYMF）降低，白细胞总数（WBC）降低，中性粒细胞百分比（GPR）升高，血小板压积（PCT）增大；血生化示总蛋白(TP)升高，尿素氮(BUN)升高，血糖(GLU)降低，而且具有统计学差异，表明Tg小鼠出现了肾功能不全，发生了自身免疫性损伤。 ②抗体重链Tg小鼠尿液分析。取小鼠尿液，经Bradford法定量后，在SDS-PAGE上进行尿蛋白电泳。结果发现与WT小鼠相比，尿蛋白含量增高，电泳以混合性蛋白尿为主，其结果提示肾脏病变主要位于肾小球。 ③抗体重链Tg小鼠组织学检查。取小鼠的脾、肝、肾、肠、肺、皮肤、骨骼肌、胃、股骨等重要器官组织进行切片及相关染色分析。目前发现主要病变在肾脏，Tg小鼠可见肾小球系膜细胞和系膜基质增生，基底膜增厚，毛细血管内微血栓形成，肾小球数量明显减少，近曲小管扩张，远曲小管上皮细胞变性，间质内可见明显的炎症细胞浸润，而WT小鼠肾小球结构正常。PAS染色显示基底膜肥厚。免疫荧光示Tg小鼠肾小球内可见明显的IgM类颗粒状荧光物质沉积，主要集中在系膜区，荧光强度在（++～+++），WT小鼠只能见到微弱的荧光，强度为（?～+）；整个肾小球内未见IgG类物质沉积。电镜发现Tg小鼠肾小球系膜区系膜细胞、系膜基质增生明显，足突细胞广泛融合，可见变性，基底膜有不规则增厚，偶见分离和双轨征。以上结果提示Tg小鼠可能患有自身免疫性疾病，尤以肾脏病变为重。 二、不同饲养环境对AK auto Ab Tg小鼠B细胞发育的影响 1．Tg小鼠转入无菌区常规环境中经鉴定的Tg小鼠，在SPF环境中行剖宫产术，其子代在此环境中饲养、鉴定、传代以备下一步观察和分析。 2．AK auto Ab Tg小鼠B细胞发育分析取不同饲养环境中的小鼠的骨髓、脾脏、腹腔和淋巴结，通过流式细胞仪检测骨髓中不同发育阶段的B细胞、脾脏中边缘带B（MZ/B）细胞、滤泡B（Fo/B）细胞以及未成熟B细胞、腹腔内分泌NAA的CD5+B1细胞的存在数量和比例，并进一步分析其等位基因排斥及T、B细胞分布情况。我们未发现不同饲养环境中细胞数量和比例存在明显差别，结果提示环境因素对Tg小鼠B细胞的发育影响不大。 本实验分析了在常规环境中Tg小鼠的表型变化，比较了不同饲养环境中的感染因素对Tg小鼠B细胞发育的作用，结果提示了天然自身抗体的过度表达对机体多系统、多器官产生重要影响；Tg小鼠有发生自身免疫性疾病的倾向，其中肾脏病变尤为突出，但它是否为小鼠的致死原因仍需进一步的研究和论证。外源感染很可能加速了疾病的进程但是对B细胞的发育影响不大。 天然自身抗体(natural autoantibodies，NAA)是在没有任何抗原免疫的情况下，正常机体产生的针对一种或多种自身抗原的抗体，其广泛存在及其功能意义的阐明表明一种生理性自身免疫机制的存在。因此，目前把自身免疫分为生理性自身免疫和病理性自身免疫。前者是指自身免疫反应在一定限度内，不造成机体损伤和功能障碍，其中NAA是生理性自身免疫的主体，在机体抗感染、免疫调节、肿瘤监视、内环境稳态的维持等方面发挥着积极的作用；后者即自身免疫性疾病（autoimmune disease, AID），是指自身免疫反应超出了一定的限度，导致了针对自身成分的免疫损伤，各种病理性自身抗体发挥了重要的作用。随着研究的进一步深入，有证据提示机体在一种或几种因素作用下，生理性自身免疫反应可能被诱导发生改变，失去了正常的调控功能，而转变成一种病理状态，造成对机体的损伤；遗传、环境、性别、内分泌等因素在这一过程中可能发挥了重要的作用。
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