CD4+CD25Treg在类风湿关节炎不同病期和TNF-α受体抗体融合蛋白治疗中的消长及其意义的研究

摘要

【背景】 类风湿关节炎(rheumatoid arthritis, RA)是以慢性多关节滑膜炎为主要特征的全身性自身免疫病，也是致残的主要疾病之一。RA的免疫学异常包括T细胞亚群失调和T细胞的异常活化。已有大量证据表明T淋巴细胞参与了RA的发病机制，包括在关节滑液中出现的CD4+、CD8+ T细胞。尽管目前对阻止自身免疫病的机制了解有限，已有研究证明调节性T细胞参与了外周耐受的形成。在已经被了解的几种调节性T细胞亚型中，最具有调节潜力的细胞存在于CD4+ 并天然表达CD25 的T细胞亚群中。这群细胞可下调CD25- T细胞的活化和增殖，从而抑制针对自身抗原的损伤性免疫应答，约占正常小鼠CD4+T细胞的10％。它们在体外呈克隆无能(anerge)状态，通过刺激T细胞抗原受体(TCR)也不能使其增殖或分泌IL-2。目前，已证明人体中也存在相同的CD4+CD25+调节性T细胞，然而，只有高水平表达CD25 的细胞才显示具有潜在的调节功能，在这里，我们称之为CD4+CD25high 调节性T细胞（CD4+CD25highTreg）。已有报道指出在RA患者外周血中存在CD4+CD25+调节性T细胞，且有报道在幼年特发性关节炎患者外周血中也存在这类细胞，然而尚未有研究报道不同病期的RA患者外周血中高表达CD25 的CD4+T细胞(CD4+CD25high )的数量是否有差别，以及RA患者使用生物制剂TNF-α受体抗体融合蛋白治疗后CD4+CD25high T细胞的变化情况。 近年还有研究表明，CD4+CD25high Treg的分化发育受转录因子Foxp3 调控，可能是CD4+CD25high Treg发育和功能维持的一个关键转录因子。鉴于CD4+CD25high T细胞在体外不丧失调节功能并可以扩增，在其缺乏或功能丧失的情况下，使用扩增的细胞将是一个明确的治疗方法。深入研究4+CD25highT细胞在RA关节损伤中的作用和机制，确定新的治疗靶点，具有十分重要的理论及应用意义。 另外，在过去的10 年中，生物制剂已成为RA治疗的主要突破点。尽管对生物制剂的研究有着日新月异的发展，但对其在RA治疗中的机制还需要进一步的研究和探讨，鉴于此，本课题还研究RA患者在接受生物制剂肿瘤坏死因子受体抗体融合蛋白（rhTNF-α）前后RA患者CD4+CD25highTreg细胞的变化及其意义。 【目的】 本课题旨在： 1. 研究不同病期RA患者外周血和滑液中CD4+CD25high Treg数量的变化，及其与关节炎活动程度的相关性，探讨CD4+CD25high T细胞在RA发生发展中的免疫抑制和调节作用； 2. 研究不同病期RA患者外周血CD4+CD25highTreg表面转录因子Foxp3 的表达情况及外周血单个核细胞（PBMC）中Foxp3 mRNA的水平，探讨Foxp3 调控CD4+CD25high Treg的作用； 3.研究RA患者在肿瘤坏死因子受体抗体融合蛋白（rhTNF-α）治疗前后CD4+CD25high Treg数量的变化，探讨肿瘤坏死因子（TNF-α）在RA发病机制中对这一T细胞亚群的影响以及二者之间的相互作用，从而为深入研究TNF-α及调节性T细胞在RA发病中的作用提供线索。 【方法】 分三大部分： 1、选择RA患者32 例(包括未经缓解病情抗风湿药(DMARDs)治疗的活动期患者11 例，经DMARDs治疗病情缓解者12 例和治疗后效果不佳者9 例)，以及正常对照8 例;另外，选取6 名有关节积液的强直性脊柱炎(ankilosingspondylitis, AS)患者。以流式细胞术检测外周血和部分患者及6 名AS患者关节滑液CD4+CD25high Treg的百分率，并研究CD4+CD25high Treg百分率与抗环瓜氨酸(CCP)抗体，C反应蛋白(CRP)，血沉(ESR)及类风湿因子(RF)的相关性。 2、选取不同病期RA患者外周血，采用流式细胞术检测CD4+CD25high Treg膜表面Foxp3 分子的表达情况，同时分离外周血淋巴细胞，采用RT-PCR方法测定Foxp3 mRNA的表达。 3、使用流式细胞术比较甲氨蝶呤（MTX）治疗组和TNF-α受体抗体融合蛋白+ MTX治疗组治疗前后RA患者外周血中CD4+CD25high Treg的变化以及此变化与病情活动的相关性。 【结果】 1 、活动期RA患者( 包括未经治疗组和治疗效果不佳组) 外周血CD4+CD25high Treg占所有CD4+T细胞的百分率（下文均简称为百分率）明显低于正常对照组和缓解期(治疗后病情缓解组，5.24％和6.43％ vs 17.17％和11.79％, P<0.01)。RA患者CD4+CD25high Treg的百分率与抗CCP抗体(58.0Ru/mL)，ESR(38.8 mm/h)及CRP(2.73 μg/L)呈明显负相关(P<0.05)，与类风湿因子(RF=14.4 Iu/mL)无明显的相关性(P=0.054)。正常对照组的CD4+CD25highTreg百分率与抗CCP抗体(均<5.0 Ru/mL)，ESR(4.67 mm/h),CRP(0.15 μg/L)及RF(1.37)无明显相关性(P>0.1)。RA患者关节滑液中CD4+CD25high Treg百分率与外周血相比有所升高（24.32 vs 11.67, P<0.01）,但明显低于AS关节积液患者(30.24 vs 24.32, P<0.05)。 2、流式细胞术检测，活动期RA患者(未经治疗组和治疗效果不佳组)外周血CD4+CD25high Treg膜Foxp3 的表达率(分别是82.43％和85.24％)明显低于正常对照组和缓解期患者(治疗后病情缓解组)(分别是97.25％和92.88％，P<0.01)。RT-PCR检测结果显示，活动期RA外周血单个核细胞中Foxp3 mRNA的表达量略低于正常对照组和缓解期RA患者。 3、流式细胞术分析显示，MTX治疗组治疗前后外周血中CD4+CD25highTreg百分率的升高值(3.67％)明显低于TNF-α受体抗体融合蛋白+ MTX治疗组治疗前后的升高值(10.13％，P<0.01)，而且后者与抗CCP抗体、ESR、CRP 及RF的变化量呈正相关（分别是14.76 Ru/mL 、17.21 mm/h 、1.27μg/L 及7.63Iu/mL, P<0.05)。 【结论】 1、试验结果表明活动期RA患者外周血CD4+CD25high Treg相对减少，且与病情活动程度负相关，提示CD4+CD25high Treg可能与RA的发病和发展有关，可能是RA发生和发展的一个重要因素;RA患者滑液中CD4+CD25high Treg百分率比外周血中多，但少于AS患者，提示CD4+CD25high Treg在关节局部发挥作用。 2、活动期RA患者外周血中，CD4+CD25high Treg膜Foxp3 的表达量低于正常对照组和缓解期RA患者，表明Foxp3 的表达量与RA的发病和发展有关，并且同CD4+CD25high Treg的变化有一定联系；但Foxp3 mRNA水平无明显差别，表明，Foxp3 在mRNA水平上并不随RA病期的改变而有所变化，也不随CD4+CD25high Treg的变化而变化，Foxp3 在RA发病机制及在CD4+CD25highTreg中的作用及其机制有待深入研究。 3、接受TNF-α受体抗体融合蛋白+MTX治疗的RA患者其外周血中CD4+CD25high Treg的升高多于单独使用MTX的患者，说明TNF-α受体抗体融合蛋白可上调CD4+CD25high Treg，提示TNF-α受体抗体融合蛋白可以通过恢复或增强患者外周耐受的机制达到治疗RA的目的;另外，接受TNF-α受体抗体融合蛋白+MTX治疗的RA患者外周血CD4+CD25high Treg的变化与患者疾病活动程度的改变呈正相关，进一步证实TNF-α受体抗体融合蛋白可以通过上调CD4+CD25high Treg来改善患者的病情，达到治疗自身免疫病的目的。 4、本研究建立了CD4+CD25high Treg及Foxp3 的检测方法，为进一步研究CD4+CD25high Treg在RA发病中的作用及深入研究RA发病机制提供理论依据和实验基础。