抗癫痫肽抗癫痫作用靶位筛选及功能探讨

摘要

癫痫是最常见的神经系统疾病之一，病程长，致残率高，易反复。资料显示，我国癫痫患病率为7‰，年发病率为28.8/10万，目前我国约有900万癫痫病人，占全世界患者的1/5～1/6，同时每年新增加病人数约40万。由于癫痫患者需要长期服用抗癫痫药物（多数达3年以上），因此极易产生耐药性；同时由于抗癫痫药物较大的毒副作用，如胃肠道刺激、肝功能损害、记忆和认知功能减退、骨损害及致痫作用等，也限制了其临床应用和疗效。约有25％～30％的患者转为难治性癫痫。因其直接威胁病人的身心健康，影响患者和家庭成员的生活质量并加重经济负担，所以寻求一种更安全有效的治疗癫痫的药物及方法，已成为医学科学研究的热点。 抗癫痫肽（anti-epilepsy peptide，AEP）是从东亚钳蝎粗毒液中分离的一种具有生物学活性的多肽，研究证实它有良好的抗癫痫作用，具有作用强、用量小、毒性低的特点。但其治疗癫痫的作用机制尚不明确。为进一步探讨AEP抗癫痫的作用机制，我们通过基因重组技术分别构建原核和真核表达载体，诱导表达重组蛋白，通过复制海人酸癫痫大鼠模型，制备脑匀浆，采用pull-down实验检测与AEP相互作用的分子，利用生物信息学方法分析靶蛋白，初步探讨AEP的抗癫痫作用机制。为研制新型的抗癫痫药物提供理论依据，也为中药的作用机理研究提供新的思路和方法。我们的研究结果可以归纳为以下几点： 1.成功构建了含有AEP基因片段的测序载体PUC18-T-AEP和原核表达载体pGEX-4T-1-AEP；将重组表达载体pGEX-4T-1-AEP转化至BL21（DE3）感受态大肠杆菌细胞中，经IPTG诱导获得了高效表达，经Western blot验证，证实为融合蛋白；对表达菌进行超声裂解，发现融合蛋白以包涵体形式存在；通过对包涵体蛋白进行洗涤、尿素变性和透析复性后，用谷胱甘肽琼脂糖珠进行了纯化。 2.复制了海人酸癫痫大鼠模型，制备脑匀浆蛋白，采用GST pull-down实验筛选AEP的相互作用蛋白，但经过多次尝试后未能达到预期目的，考虑与AEP分子量较小，而与其融合的分子伴侣GST较大，掩盖了其有效结合位点有关。 3.通过基因重组技术，构建了AEP二串体毕赤酵母表达载体pPIC9K-AEP2-His，电转化至毕赤酵母菌SMD1168感受态细胞，采用G418筛选出高拷贝的转化子，用pPIC9K载体自带通用引物进行PCR反应，鉴定AEP2-His基因整合于染色体基因组中后，甲醇诱导在毕赤酵母中获得表达，用抗His单克隆抗体进行Western blot验证；用Ni-chelating Sepharose FF柱纯化AEP2-His蛋白，纯化后用BCA蛋白定量试剂盒定量并进行了电泳鉴定。 4.复制海人酸癫痫大鼠模型，并取海马组织，采用膜蛋白提取试剂盒提取海马组织细胞膜蛋白，与结合有AEP2-His蛋白的Ni-chelating Sepharose FF柱共孵育，通过His pull-down筛选AEP的相互作用分子，同时设对照。结果提示：与对照组相比，AEP2-His蛋白孵育组有4条比较明显的蛋白条带，将这4条蛋白条带切取下来，进行质谱分析。质谱分析表明：这4种蛋白分别为突触前膜蛋白SNAP-25、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）、谷氨酰胺受体（NMDAR）、谷氨酸脱羧酶（GAD）。因此我们推测这4中蛋白可能就是AEP发挥抗癫痫作用的靶蛋白，至于他们之间是通过何种分子通路进行信号转导而发挥抗癫痫作用的，尚待进一步研究。