缺氧条件下外源性血管内皮生长因子对大鼠Müller细胞的影响

摘要

研究背景：在缺血性视网膜疾病中，多种视网膜细胞分泌大量VEGF。它不仅能促进新生血管形成、增加血视网膜屏障通透性，还对各种视网膜细胞产生一定影响。尽管VEGF抑制剂已应用于临床，但是其对某些视网膜细胞作用的机制尚不清楚，如VEGF 对Müller细胞的影响。Müller细胞是视网膜中主要的胶质细胞，在维持视网膜正常结构、代谢及功能方面起着重要作用。 在缺血性视网膜疾病中，Müller 细胞会反应性增生，这与多种视网膜细胞分泌的多种细胞因子刺激有关。我们研究缺氧条件下和外源性VEGF 对Müller细胞的影响。 目的 1. 用CoCl2 建立Müller 细胞化学缺氧模型，观察缺氧对大鼠Müller 细胞活性的影响。 2. 观察缺氧条件下外源性血管内皮细胞生长因子（VEGF）对大鼠Müller 细胞活性的影响。 方法 1. Müller 细胞培养与鉴定：出生1 wk 以内SD 大鼠，分离并剪碎视网膜组织，胰蛋白酶消化，将含有混悬细胞的消化液通过53μm 尼龙筛网过滤后，收集滤液，获得混合游离细胞，加入20％胎牛血清培养液中培养，3 d换液。改良酶消化法纯化细胞2～3 遍，按1:2 比例传代，传至第2～3 代后采用GFAP 和谷氨酰胺合成酶(GS)抗体免疫组化染色方法鉴定。 2. 氯化钴法建立Müller 细胞化学缺氧模型：将经纯化鉴定传至3~5 代融合前的Müller 细胞培养24 h 后置于含有200 μM CoCl2 的培养液内培养0、4、8、12、16、20 和24 h，采用MTT[3(4,5 dimethylthiazole 2yl) 2,5 diphenyltetrazolium bromide]比色法检测细胞增生活性，免疫细胞化学法和积分吸光度(IA)检测GFAP、VEGF、Flt-1 和Flk-1 的表达，TUNEL 法检测细胞凋亡，观察缺氧对Müller 细胞的影响。 3. 不同浓度VEGF 对缺氧Müller 细胞的影响：在缺氧24 h 之前加入10、25、50、75 和100 μg/L VEGF，继续培养24 h，采用MTT 法和TUNEL 法检测。 4. 75 μg/L VEGF 对不同缺氧时间下Müller 细胞的影响：缺氧前加入75 μg/LVEGF 培养24 h，再置于含有200 μM CoCl2 的培养液中培养0、4、8、12、16、20 和24 h，采用MTT 法和TUNEL 法检测。 5. SU1498 对Müller 细胞的影响：缺氧前24 h 时加入75 μg/L VEGF，同时加入700 μg/L SU1498，采用MTT 法和TUNEL 法检测。 结果 1. 酶消化法纯化后剩下的细胞多数为Müller 细胞。第3 代的Müller 细胞经GFAP 和谷氨酰胺合成酶染色鉴定其纯度为90％，活力是87.3％。 2. Müller 细胞的GFAP 染色在缺氧后增强(P<0.05)。缺氧后0、4、8、12、16、20 和24 h 时IA 分别为1933±79、2005±98、2451±87、2396±86、2092±129、1892±63 和1659±55。12 h 后可观察到细胞肿胀、脱落，但16h 时细胞活力仍为83％。VEGF 缺氧后表达量呈持续上升趋势(P<0.01)，于24 h 达到48.4±1.4。常氧下Flk-1 和Flt-1 表达量分别为2.3±0.5 和2.0±0.7。但缺氧后4、8、12、16、20 和24 h 时Flk-1 和Flt-1 表达量分别为2.3±0.5、4.1±0.2、5.1±2.3、10.3±3.1、12.5±3.3、17.2±3.2、18.4±3.4和2.0±0.7、4.2±1.5、17.4±1.5、25.4±2.3、30.2±1.8、31.6±2.2、33.5±1.9。24h时细胞增生活性(A)降低到72.7％，而细胞凋亡指数增加了8.2倍。 3. 细胞在缺氧前24 h 时加入VEGF，终浓度为50、75、100 μg/L 的VEGF对细胞有明显促增生作用，细胞活性增加，凋亡减少，并呈剂量依赖性。 75μg/LVEGF 作用后细胞活性达0.201 ± 0.031，凋亡指数达12 ± 1.2；100μg/LVEGF 作用后细胞活性达0.199 ± 0.007，凋亡指数达11 ± 1.5。与对照组相比均有显著性差异(P<0.05)，但两者之间差异不显著(P>0.05)。添加75 μg/L VEGF 后经不同时间缺氧，与对照组相比，细胞数增多，活性增强，凋亡指数下降，缺氧24 h 时细胞活性增强了1.3 倍，凋亡指数下降到2/3。 4. VEGF+SU1498 组和VEGF 组缺氧24 h 后细胞活性分别为0.129 ± 0.002和0.168 ± 0.005，凋亡指数分别为14 ± 1.8 和12 ± 1.5。与未加VEGF、SU1498 的对照组相比，SU1498 明显抑制了VEGF 对Müller 细胞的作用(P<0.05)。 结论 1. 短时间缺氧首先刺激Müller 细胞增生，活性增加，随着缺氧时间延长，细胞受到损伤，部分细胞肥大肿胀死亡，活性降低，凋亡指数增加，GFAP、VEGF 及其受体（Flk-1、Flt-1）的表达增加并呈时相依赖性。 2. 缺氧前加入不同浓度VEGF 能够促进Müller 细胞增生，活性增强，凋亡指数下降，并呈浓度依赖性，说明VEGF 对缺氧的Müller 细胞有保护作用，这种保护机制可能由受体Flk-1 介导。 本实验创新点：初步探索了VEGF对缺氧条件下大鼠Müller细胞的影响及机制，该研究在国内外未见报道。