全身清除单核-巨噬细胞对激光诱导的小鼠脉络膜新生血管生成的影响

摘要

研究背景 脉络膜新生血管（CNV）可发生在多种眼部疾病中，如年龄相关性黄斑变性（AMD）、特发性脉络膜新生血管、眼组织胞浆菌病综合征（OHS），以及眼底血管样条纹（AS）、病理性近视和外伤性脉络膜破裂等。 CNV 好发于黄斑，由其引发的渗出、出血及瘢痕形成等改变可导致视力丧失，是致盲的主要原因之一。如何防治CNV 是当前眼科学研究的重要课题。CNV的病因及发病机制尚不明确，可能与增龄性改变、缺氧、以及其他引发Bruch膜损伤或细胞外基质（ECM）改变的多种因素相关。近期研究发现，眼部的炎症反应和免疫活化在CNV 的发生和发展中也起着重要的作用，其中巨噬细胞（Mφ）可能起主要作用。在手术切除CNV 标本和CNV 动物模型中均可见Mφ浸润；CNV 中的Mφ可产生多种血管活性因子和炎症介质，如血管内皮生长因子（VEGF）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）和肿瘤坏死因子（TNF-α）等；Mφ与视网膜色素上皮（RPE）细胞之间存在的正反馈作用提示，与RPE 细胞的相互作用在CNV 的发生发展中可能起着关键的作用；减少Mφ在激光斑处的浸润可减轻激光诱导CNV 的严重程度。因此研究Mφ在CNV 发生发展中的作用将有助于了解CNV 的生成机制，为有效防治CNV相关疾病提供思路。 目的 观察全身清除单核-巨噬细胞对激光诱导的小鼠CNV 生成率的影响，探讨Mφ在CNV 生成中的作用及其机制。 方法 采用腹腔注射Cl2MDP-lip方法全身清除单核-巨噬细胞。对4 只Cl2MDP-lip小鼠（正常成年C57BL/6J小鼠，腹腔注射Cl2MDP-lip原液0.2ml/只），PBS-lip小鼠（腹腔注射PBS-lip原液，0.2ml/只）及正常小鼠（不进行任何注射）各1 只，通过流式细胞仪分析注射后2d血液中单核细胞数量和免疫组化法观察脾脏中的Mφ数量，以确定药物效果。选取70 只正常成年C57BL/6J小鼠，每只动物随机选一只眼，采用532nm倍频激光光凝法建立CNV模型。 实验分为3 组：①正常对照组（30 只），即只建立CNV模型，不进行其他干预；②全身清除单核-巨噬细胞组（Cl2MDP-lip组，20 只），于激光光凝前3d、1d及光凝后1d、3d等4 个时间点腹腔注射Cl2MDP-lip原液（0.2ml/只/次）；③PBS-lip平行对照组（PBS-lip组，20 只），每只小鼠于上述4 个时间点腹腔注射PBS-lip原液0.2ml/只/次）。各组分别于光凝后7d和14d行眼底荧光素血管造影（FFA）检查，于3d、14d、28d和56d摘除眼球制作眼后段组织切片，进行组织病理学观察，以了解CNV生成率及其严重程度。对Cl2MDP-lip组和正常对照组小鼠激光后3d的眼球组织切片行免疫荧光染色，观察激光斑处Mφ浸润、内皮细胞增生、以及VEGF蛋白表达的情况。 结果 与正常小鼠和PBS-lip小鼠相比，腹腔注射Cl2MDP-lip后2d时，Cl2MDP-lip小鼠血液单核细胞明显减少，脾脏组织内Mφ几近消失，表明腹腔注射Cl2MDP-lip 可有效清除单核- 巨噬细胞。正常对照组/PBS-lip 组/Cl2MDP-lip组小鼠激光后7d和14d时CNV生成率分别为60.68％/60.12％/62.30％和61.84％/61.90％/62.5％（P>0.05）；激光后3d，Cl2MDP-lip组小鼠激光损伤处细胞密度明显下降（P<0.05）；激光后14d时，CNV厚度及面积明显小于其他两组（P<0.05）；28d时，CNV面积小于其他两组（P<0.05），但CNV厚度差异不显著（P>0.05）；56d时，各组间CNV厚度及面积均无明显差异（P>0.05）；PBS-lip组与正常对照组各指标无明显差异（P>0.05）。 与正常对照鼠比较，Cl2MDP-lip小鼠激光后3d光斑处Mφ明显减少（P<0.001），内皮细胞及VEGF表达量亦呈减少趋势。 结论 早期全身清除单核-巨噬细胞可减轻CNV 生成的严重程度，但并不能阻止CNV 的生成。这种作用可能是通过减少内皮细胞等细胞的增生浸润和下调VEGF 等生长因子的表达量而实现的。