急性CO中毒迟发性脑病大鼠模型脑内免疫因子表达及胶质细胞变化的研究

摘要

一氧化碳（carbon monoxide，CO）是由碳原子不完全燃烧产生的无色、无味、结构稳定的毒性气体。CO中毒是当今发生率和死亡率最高的中毒。 多见于火灾，机动车尾气异常泄漏和工业或家庭燃气炉取暖、做饭及沐浴等发生的事故中，也可见于CO自杀。CO中毒经过治疗，多数可以康复，但仍有3％~30％的患者经过一段时间的“假愈期”（数日或数周），再次出现以痴呆、精神症状和锥体外系症状为主的神经精神异常，称为CO中毒迟发性脑病，简称迟发性脑病（delayed neuropsychologic sequelae，DNS ），目前其发病机制仍未阐明。 近年，DNS的免疫机制越来越受到人们的重视。传统观点认为，中枢神经系统（central nervous system，CNS）是“免疫特免区”。但近年的研究表明，CNS并非绝对的免疫特免区，在特定条件下，CNS血脑屏障通透性会发生改变，允许血液中的免疫成分进入脑内，同时CNS内出现抗原提呈细胞（antigen presenting cells，APC）和免疫效应细胞，释放各种免疫因子、激活APC提呈抗原，发挥抗原清除作用。CO中毒患者大脑缺血再灌注过程中会生成大量的自由基，这些自由基易使细胞膜脂质过氧化反应增强，脑组织在某些脂质过氧化产物的作用下，极有可能发生蛋白变性等病理改变，产生抗原性物质，而且脑内的脂质过氧化产物本身也可作为抗原，激发CNS的免疫反应。DNS的发病过程有一个明显的“假愈期”，很有可能是脑损伤后CNS免疫反应中免疫细胞的激活过程所致。 胶质细胞（neuroglia cells）在神经系统的生理活动中，起支持、营养、保护和修复神经元的作用，是神经系统不可缺少的部分。脑损伤时，不仅神经元出现损伤，胶质细胞也通过增生、变形或分泌某些细胞因子对损伤产生反应。中枢神经系统损伤时，胶质细胞对神经元具有损害和保护双重作用。哺乳动物胚胎期神经系统的发育成熟过程中，神经干细胞（neural stem cells，NSCs）可分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。而正常成年哺乳动物CNS中仅存在少量神经干细胞，主要聚集在侧脑室壁的脑室下区(subventricular zone，SVZ)和海马齿状回的颗粒下层(subgranular zone，SGZ)。 脑损伤后神经干细胞可通过增殖、迁移和分化，修复脑组织损伤。CO中毒DNS患者发生脑损伤后，脑内胶质细胞及可分化为胶质细胞的NSCs的变化应该也有一定的规律。高压氧(hyperbaric oxygen，HBO)治疗DNS效果显著,提示HBO可能通过影响DNS后胶质细胞的变化而改善患者的临床症状。 基于以上假设，本研究旨在通过建立DNS 大鼠模型，观察与免疫反应有关的因子，主要组织相容性复合体Ⅱ（major histocompatibility complexⅡ，MHCⅡ）和γ-干扰素（interferon γ， IFN-γ）在DNS 大鼠脑中的表达情况，分析是否有免疫因素参与急性CO 中毒DNS 的发病过程，探讨该病的发病机制；在此模型上进一步观察脑内星形胶质细胞、少突胶质细胞、小胶质细胞、神经干细胞和神经元的变化，同时给予HBO 治疗后，观察HBO 对上述细胞变化的影响，进一步探讨急性CO 中毒DNS 的发病机制及HBO 治疗DNS 的作用机制。我们采用急性静态CO 吸入法建立急性CO 中毒迟发性脑病大鼠模型，通过组织病理学技术观察模型大鼠脑皮质及海马神经元病理形态学改变的特点；并采用免疫组织化学技术观察细胞因子MHCⅡ和IFN-γ的表达、胶质细胞和神经干细胞的变化及HBO 治疗对上述细胞变化的影响。 其主要结果如下： （一）脑组织病理形态学改变H-E染色标本上，DNS组大鼠脑内发生广泛的病理改变，皮质、海马及齿状回出现大量的神经元变性坏死。顶叶皮质损伤最为严重，可见点片状坏死，坏死神经元呈三角形或多角形，细胞缩小，胞核固缩，核仁不清晰，周围出现空晕，在变性坏死的神经元周围可见胶质细胞增生；海马锥体细胞层变薄，两侧细胞稀疏，CA1区坏死明显。以上病理改变在染毒后各时间点均可观察到，以染毒7d最为明显。细胞超微结构观察可见对照组海马区神经元大小正常，核膜完整，核仁清晰，细胞器完整，DNS组大鼠坏死神经元体积增大，线粒体肿胀，细胞器崩解，染色质密度增大，不均匀分布。 （二） MHCⅡ和IFN-γ的免疫组化染色对照组无或仅有少量MHCⅡ和IFN-γ表达，而DNS组在皮层和海马区则有表达。MHCⅡ3d表达增强，7d数量较3d组多，表达达高峰（P<0.05），10d呈零星分布，20d几乎无阳性细胞。IFN-γ 3d为表达高峰，7d有所下降，数量较3d组少（P<0.05），10d、20d呈零星分布。 （三）脑内胶质细胞和神经干细胞的变化免疫组化结果显示DNS组与对照组比较，少突胶质细胞特征性标志物（RIP）、巢蛋白（nestin）表达减少（P<0.05）；胶质纤维酸性蛋白（GFAP）、小胶质细胞特征性标志物（OX-42）的表达明显增多（P<0.05），且阳性细胞形态发生改变，呈激活状态。HBO治疗组nestin、RIP较对照组表达减少（P<0.05），与DNS组相比数量增多（P<0.05）；GFAP、OX-42较对照组表达增多（P<0.05），与DNS组相比数量减少（P<0.05）。 总之，通过本实验的研究证明，急性CO中毒迟发性脑病大鼠模型脑中出现了免疫因子MHCⅡ和IFN-γ的表达。位置上，它们主要出现在神经元变性坏死部位；时程上，它们的表达有一定的时间差。实验还发现，模型大鼠脑内胶质细胞形态、数量均发生变化，小胶质细胞激活现象出现的位置和时程与MHCⅡ表达一致，且MHCⅡ形态上与小胶质细胞相似。因此，推测急性一氧化碳中毒后，脑组织在多种因素作用下，引起神经元损伤和胶质细胞形态数量变化，损伤的神经元和胶质细胞释放细胞因子IFN-γ，使静息的小胶质细胞被激活成为抗原提呈细胞，同时表达MHCⅡ，APC将与MHCⅡ结合的抗原提呈给T淋巴细胞，造成脑组织免疫损伤，导致继发性脑损害，最终引起该区域神经元的迟发性坏死，同时由于神经干细胞数量减少，脑组织修复能力降低，引起迟发性脑病的发生。在上述实验的基础上，进一步的研究重点应是找到免疫反应的直接证据，包括寻找造成该反应的免疫原、免疫效应细胞，并探究其出现的机制。